外源香蕉枯萎病菌基因小分子RNA對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響.pdf

1、香蕉枯萎病危害著我國(guó)和世界香蕉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，是亟待解決的世界性難題。寄主植物誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)是培育廣譜和持久抗病性的香蕉新種質(zhì)的有效途徑之一。前期通過(guò)對(duì)香蕉枯萎病菌早期發(fā)育蛋白質(zhì)組和24種營(yíng)養(yǎng)親和型病原菌基因組的深入分析，發(fā)現(xiàn)麥角甾醇生物合成途徑FoERG6、FoERG11、FoERG13和FoERG25蛋白對(duì)病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，是極佳的防控靶標(biāo)位點(diǎn)。其中FoERG6蛋白有兩個(gè)同源基因編碼即FoERG6A、FoERG6B，F(xiàn)oE

2、RG11蛋白有三個(gè)同源基因編碼即FoERG11A、FoERG11B、FoERG11C，F(xiàn)oERG13蛋白有三個(gè)同源基因編碼即FoERG13A、FoERG13B、FoERG13C，F(xiàn)oERG25蛋白有三個(gè)同源基因編碼即 FoERG25A、FoERG25B、FoERG25C。本研究主要通過(guò)從體外外飼靶標(biāo)基因小分子RNA處理香蕉枯萎病菌熱帶四號(hào)生理小種（Foc TR4）和一號(hào)生理小種（Foc Race1），探索其抑菌效果及相關(guān)分子機(jī)理，為香蕉

3、抗病分子育種提供理論依據(jù)。獲得如下結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了分別表達(dá) Foc TR4 ERG6、ERG11、ERG13和 ERG25雙鏈 RNA（dsRNA）的原核表達(dá)載體和香蕉遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體
　　均以“正向片段+內(nèi)含子+反向片段的”的形式,將四個(gè)靶標(biāo)基因的特異干涉片段構(gòu)建了由prrn強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)、能在大腸桿菌HT115（RNaseIII缺失體）中表達(dá)完整dsRNA的載體DI-T-P中；以及由Ubi強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，適合在香蕉

4、中表達(dá)dsRNA的載體pYL-RNAi中。通過(guò)定量PCR檢測(cè)了陽(yáng)性菌株中上述基因dsRNA的表達(dá)量；通過(guò)寄主植物誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)，獲得了含有 FoERG6和 FoERG11干涉片段的轉(zhuǎn)基因香蕉植株（由博士生竇同心完成）。
　　2．四個(gè)靶標(biāo)蛋白編碼基因的dsRNA對(duì)Foc TR4和Foc Race1病原菌的早期發(fā)育都有顯著的抑制效果
　　提取含靶標(biāo)基因dsRNA的陽(yáng)性菌株總RNA，在體外對(duì)Foc TR4和Foc Race1進(jìn)行

5、外飼處理，加入總RNA的濃度為500 ug/ul，孢子處理濃度為1×105conidia/ml，分別在12、24和48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)取樣觀察，發(fā)現(xiàn)四個(gè)靶標(biāo)基因的dsRNA對(duì)Foc TR4和 Foc Race1早期發(fā)育均表現(xiàn)出顯著的抑制作用，其中 FoERG11和 FoERG25 dsRNA的抑菌作用優(yōu)于FoERG6和FoERG13,并說(shuō)明靶標(biāo)蛋白編碼基因序列在香蕉枯萎病菌中高度保守。
　　3.經(jīng)靶標(biāo)基因dsRNA處理后Foc TR4中

6、相應(yīng)的靶標(biāo)基因、麥角甾醇和膽固醇生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)譜變化
　　Foc TR4經(jīng)靶標(biāo)基因dsRNA處理0和12小時(shí)后，運(yùn)用定量PCR對(duì)靶標(biāo)基因、麥角甾醇和膽固醇生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)自身基因都顯著下調(diào)，其他麥角甾醇途徑中的基因即ERG3A、ERG3B、ERG4、ERG6A、ERG6B、ERG11A、ERG11B、ERG11C、ERG13、ERG11A、ERG11B、ERG11C和ERG25均顯著下調(diào)表達(dá)

7、，膽固醇合成途徑中的基因即TGL、ARE1A和ARE1B均顯著上調(diào)表達(dá)。說(shuō)明外飼靶標(biāo)蛋白編碼基因的dsRNA，都能有效抑制四個(gè)蛋白編碼的靶標(biāo)基因的表達(dá)，同時(shí)也影響到了麥角甾醇生物合成途徑中其它基因和膽固醇合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)。
　　4.高通量測(cè)序分析轉(zhuǎn)基因香蕉植株中小分子RNA的表達(dá)
　　課題組其他成員運(yùn)用寄主植物誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)，就是讓香蕉表達(dá) dsRNA來(lái)沉默入侵病菌細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)基因，以達(dá)到干擾病菌麥角甾醇生物合成、破

8、壞其生物膜功能的目的。首先獲得了對(duì)香蕉枯萎病有一定廣譜抗性的新種質(zhì) RNAi-FoERG6和 RNAi-FoERG11。本研究選擇野生型和四個(gè)不同轉(zhuǎn)基因株系（RNAi-ERG6-8、RNAi-ERG6-36、RNAi-ERG11-43、RNAi-ERG11-52）進(jìn)行小分子 RNA測(cè)序分析，靶標(biāo)基因小分子 RNA（siRNAs）的表達(dá)量占香蕉總量的1.96％、2.02%、5.47%和6.20%。此外，外飼含靶標(biāo)基因siRNA的轉(zhuǎn)基因香蕉

9、汁液，也能有效抑制Foc TR4的早期發(fā)育。說(shuō)明在轉(zhuǎn)基因香蕉異源表達(dá)枯萎病菌Foc TR4FoERG6和FoERG11基因的siRNAs能顯著提高它們的抗病性。
　　綜上所述，本研究證明Foc TR4的ERGs基因序列在香蕉枯萎病菌小種間非常保守；Foc TR4能夠吸收外飼的完整dsRNA和siRNA，并引發(fā)體內(nèi)的RNAi沉默機(jī)制；再次說(shuō)明抑制香蕉枯萎病菌麥角甾醇生物合成途徑，干擾其生物膜功能，能有效抑制病原菌的生長(zhǎng)。由于ERGs