HINT1基因?qū)θ撕谒亓黾?xì)胞A375生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、黑素瘤是惡性程度很高的皮膚腫瘤，其發(fā)生機(jī)制目前仍不十分清楚。腫瘤抑制基因在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白1(histidine triad nucleotide-binding protein 1，HINTl)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中表達(dá)下降，但其功能尚不完全清除。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，HINT1基因在人黑素瘤中表達(dá)下降。本試驗(yàn)旨在研究HINT1基因?qū)θ撕谒亓黾?xì)胞A375生物學(xué)行為的影響，以探討

2、其在人黑素瘤發(fā)生中的作用及機(jī)理。
　　 1、低表達(dá)HINT1的黑素瘤細(xì)胞株的篩選
　　 應(yīng)用半定量RT-PCR及蛋白印跡法檢測(cè)了人黑素瘤細(xì)胞A375及M14中HINT1的表達(dá)情況，選取低表達(dá)HINT1的A375細(xì)胞用于后續(xù)的試驗(yàn)。
　　 2、HINT1重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定
　　 應(yīng)用RT-PCR法從人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中獲得HINT1編碼區(qū)基因片段，體外構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcD

3、NA.3.1/myc-His(-)A-HINT1，經(jīng)菌落PCR、雙酶切及基因測(cè)序檢測(cè)證實(shí)此重組真核表達(dá)載體構(gòu)建正確。將其脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人黑素瘤細(xì)胞A375，經(jīng)G418篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)法及蛋白印跡法均證實(shí)，該細(xì)胞可高表達(dá)HINT1蛋白。
　　 3、HINT1對(duì)A375細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制的探討
　　 經(jīng)MTT、流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)HINT1在體外可顯著抑制A375細(xì)胞

4、增殖，促進(jìn)其凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞周期出現(xiàn)G1期阻滯。分光光度法及蛋白印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)HINT1可導(dǎo)致bax、CytochromeC及p53表達(dá)增加，bcl-2表達(dá)降低，激活Caspase9及Caspase3，從而通過(guò)線粒體依賴凋亡途徑誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡。
　　 4、HINT1對(duì)A375細(xì)胞裸鼠皮下異種移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　 高表達(dá)HINT1在裸鼠體內(nèi)可顯著抑制A375細(xì)胞裸鼠皮下異種移植瘤的生長(zhǎng)，腫瘤體積及重量均顯著

5、降低。組織病理結(jié)果顯示，HINT1高表達(dá)組腫瘤團(tuán)塊體積較小，細(xì)胞異型性低，腫瘤團(tuán)塊內(nèi)僅見(jiàn)少數(shù)局灶性壞死。
　　 5、結(jié)論：
　　 HINT1在體內(nèi)、外均能有效地抑制人黑素瘤細(xì)胞A375的生長(zhǎng)，在體外還能引起A375細(xì)胞細(xì)胞周期G1期阻滯，并通過(guò)線粒體依賴凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提示HINT1是一個(gè)腫瘤抑制基因，具有抑制人黑素瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的功能，在黑素瘤的發(fā)生及發(fā)展中具有重要的作用，可作為黑素瘤基因治療潛在的候選基