東海原甲藻和米氏凱倫藻對(duì)氮、磷限制的分子響應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、本研究以東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)和米氏凱倫（Karenia mikimotoi Hansen）為對(duì)象，采用高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)、熒光定量PCR和生理生化等多種研究手段，揭示東海原甲藻在氮、磷限制條件下的氮磷代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)制，以及相較于氮磷飽和條件下，在磷限制條件下進(jìn)行不同形態(tài)磷源恢復(fù)時(shí)，東海原甲藻氮、磷代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)豐度和差異，并闡明米氏凱倫藻在氮磷飽和條件下的氮、磷代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)制

2、，從而為探討磷營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)的改變對(duì)浮游植物種間競(jìng)爭(zhēng)的影響和開(kāi)展海洋赤潮藻類對(duì)不同磷源利用特征的研究提供一定的分子理論依據(jù)。
　　采用RNA-seq技術(shù)鑒定不同條件下東海原甲藻基因的表達(dá)差異，并獲取飽和條件下米氏凱倫藻的轉(zhuǎn)錄本基因庫(kù)及構(gòu)建米氏凱倫藻氮磷轉(zhuǎn)運(yùn)和同化利用假定模型。通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果，并分析東海原甲藻在磷限制條件下進(jìn)行不同形態(tài)磷源恢復(fù)時(shí)，氮、磷代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)豐度和差異；最后通過(guò)生物信息學(xué)分析，并結(jié)

3、合細(xì)胞密度計(jì)數(shù)、光合作用效率測(cè)定和磷營(yíng)養(yǎng)鹽測(cè)定等探索東海原甲藻的氮磷代謝途徑，構(gòu)建東海原甲藻氮磷轉(zhuǎn)運(yùn)和同化利用假定模型。
　　氮限制12h條件下，通過(guò)RNA-seq發(fā)現(xiàn)了東海原甲藻差異表達(dá)基因，其中有34個(gè)基因上調(diào)、31個(gè)基因下調(diào)；磷限制12h條件下，也發(fā)現(xiàn)了東海原甲藻差異表達(dá)基因，其中有224個(gè)基因上調(diào)、507個(gè)基因下調(diào)。熒光定量PCR證實(shí)了高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異表達(dá)結(jié)果的可靠性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺磷處理后，RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化磷酸化、光合作

4、用、胞吞作用、嘧啶代謝、糖酵解/糖異生作用、氨基酸生物合成代謝、維生素消化吸收、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)加工過(guò)程等相關(guān)的基因表達(dá)顯著下調(diào)，而核糖體蛋白代謝途徑的基因的表達(dá)顯著上調(diào)；缺氮處理后，RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化磷酸化、光合作用、胞吞作用、嘧啶代謝、氨基酸生物合成代謝、煙酸鹽和尼克酰胺代謝、維生素消化吸收、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)加工過(guò)程等相關(guān)的基因表達(dá)顯著下調(diào)，而核糖體蛋白代謝途徑的基因的表達(dá)顯著上調(diào)。結(jié)合高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)基因注釋和KEGG分析，構(gòu)建了東海

5、原甲藻和米氏凱倫藻氮磷轉(zhuǎn)運(yùn)和同化利用假定模型，較詳盡地呈現(xiàn)了氮、磷代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)制。
　　研究發(fā)現(xiàn)東海原甲藻、米氏凱倫藻細(xì)胞膜上除存在幾種常見(jiàn)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因外，還存在直接吸收大分子有機(jī)物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，為聚胺轉(zhuǎn)座子（PUT。Polyamine transporter）、寡肽轉(zhuǎn)座子（PepT，Oligopeptide transporter）；此外，東海原甲藻細(xì)胞膜上還存在核苷轉(zhuǎn)座子（ENT，Nucleoside transpo

6、rter），而米氏凱倫藻則擁有4種類型的脲酶輔助蛋白UreD/F/G/H，這些都使得東海原甲藻、米氏凱倫藻在利用可溶性有機(jī)氮、浮游植物種間競(jìng)爭(zhēng)和群落演替方面較其他浮游植物種類占有較大優(yōu)勢(shì)，這可能是國(guó)內(nèi)相應(yīng)海域頻繁爆發(fā)東海原甲藻和米氏凱倫藻赤潮災(zāi)害的原因之一。
　　此外，東海原甲藻、米氏凱倫藻細(xì)胞膜上除存在常見(jiàn)的無(wú)機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)座子（Inorganic phosphate transporter）外，還存在無(wú)機(jī)二磷酸酶/氫轉(zhuǎn)移焦磷酸酶（

7、inorganic diphosphatase/hydrogen-translocating pyrophosphatase）基因、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)座子（ABC transporter）、能直接吸收大分子溶解態(tài)有機(jī)磷的磷脂轉(zhuǎn)座子（Phospholipid transporter）和有機(jī)膦酸酯跨膜轉(zhuǎn)運(yùn) ATP酶基因（organic phosphonate transmembrane-transporting ATPase）。此外，東海原甲藻

8、細(xì)胞膜上還存在直接吸收小分子溶解態(tài)有機(jī)磷的戊糖磷酸轉(zhuǎn)座子（Triose-phosphate transporter）基因。兩種藻均含有堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase），只不過(guò)東海原甲藻的堿性磷酸酶基因位于細(xì)胞膜上，而米氏凱倫藻則位于細(xì)胞外基質(zhì)中，且兩種藻都為混合營(yíng)養(yǎng)型甲藻。
　　研究表明，自然海域中與小分子有機(jī)磷（焦磷酸、ATP）和大分子有機(jī)磷（磷脂、有機(jī)膦酸酯）結(jié)構(gòu)相似的溶解有機(jī)磷在一定程度上也可以為東海原