宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠高脂血癥的發(fā)生機制及共軛亞油酸營養(yǎng)調(diào)控.pdf

1、研究背景:
　　 大量的流行病學研究證實宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)與成年期代謝綜合征(MS)密切相關(guān)。母孕期蛋白營養(yǎng)不良是目前探討IUGR個體發(fā)生MS具體機制的常用模型之一。目前，針對IUGR個體成年期出現(xiàn)高血壓、胰島素抵抗和糖代謝紊亂及其可能機制已在母孕期營養(yǎng)不良所致IUGR動物模型中得到證實和探討，但是有關(guān)IUGR對脂質(zhì)代謝的影響結(jié)論差異很大。因此，本研究試圖探討IUGR大鼠生后從出生至成年血脂的動態(tài)變化規(guī)律以及成年期是否發(fā)生

2、高脂血癥。肝臟及脂肪組織是機體脂質(zhì)代謝的重要器官，IUGR個體生后發(fā)育期是否出現(xiàn)了肝臟及脂肪組織結(jié)構(gòu)的改變，目前并不清楚。我們將從組織結(jié)構(gòu)上進一步證實IUGR對大鼠生后脂質(zhì)代謝的影響。
　　 過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，PPARs有3種亞型:PPARα、PPARβ（亦稱PPARδ）和PPARγ。PPARα主要表達在肝臟組織，與脂代謝有關(guān);PPARγ主要在脂肪組織中表達，具有多種

3、生物學效應，在脂肪細胞分化、糖脂代謝中起重要作用。目前已經(jīng)證實PPARs的異常表達通過調(diào)控機體脂肪酸代謝及脂肪細胞分化參與了代謝綜合征的發(fā)生。然而，IUGR個體生后整個發(fā)育期組織細胞PPARs表達水平的動態(tài)變化規(guī)律以及其調(diào)控的脂肪酸代謝和脂肪細胞分化是否參與IUGR大鼠成年期高脂血癥的發(fā)生？尚未見報道。我們將從PPARα及其調(diào)控的脂肪酸代謝關(guān)鍵靶基因Cpt(l)a、Acox1及Acox3和PPARγ及其介導的脂肪細胞分化兩個方面探討IU

4、GR大鼠成年期發(fā)生高脂血癥的可能機制。同時，脂肪組織可以分泌瘦素、脂聯(lián)素及脂肪細胞脂肪酸結(jié)合蛋白(AFABP)等脂肪細胞因子，這些因子的異常改變亦廣泛參與了MS的發(fā)生，而且循環(huán)中部分脂肪細胞因子可以早期預測MS。IUGR大鼠循環(huán)中脂肪細胞因子的動態(tài)變化規(guī)律，目前并不清楚，能否作為IUGR個體成年期高脂血癥的早期預測因子，亦有待進一步探討。
　　 目前，PPARs已經(jīng)作為MS治療的一個重要靶點。共軛亞油酸(CLA)作為必須脂肪酸參

5、與機體脂質(zhì)代謝，同時可以通過上調(diào)PPARs的表達及活性，發(fā)揮降血脂等生理功能。在IUGR這一特殊群體，CLA營養(yǎng)干預能否通過影響組織細胞PPARs的表達及活性，進而調(diào)控機體脂肪酸代謝及脂肪細胞分化，從而早期預防成年期高脂血癥的發(fā)生？這將為IUGR群體成年期高脂血癥的早期防治提供理論依據(jù)。
　　 第一部分IUGR大鼠發(fā)育期脂質(zhì)代謝及肝臟和脂肪組織結(jié)構(gòu)的變化
　　 目的: 建立并評估IUGR大鼠模型,觀察IUGR大鼠生后的體

6、重增長模式,發(fā)育期血脂的動態(tài)變化以及肝臟組織和脂肪組織結(jié)構(gòu)的改變。
　　 方法: 采用健康三月齡SD二級大鼠雌性和雄性各16只,母鼠受孕成功后隨機分為對照組和IUGR組。IUGR組母鼠孕期全程予以10%低蛋白飲食,對照組母鼠孕期全程予以21%蛋白正常飼料喂養(yǎng),兩組母乳哺乳期及仔鼠斷乳后均予以正常飼料喂養(yǎng)。兩組仔鼠于1d、7d、21d、2m及3m齡時稱重,留取血清、肝臟組織及脂肪組織標本,每組每個時間點的樣本量為8個。采用氧化酶法

7、測定血清及肝臟組織甘油三酯(TG)含量；銅顯色法測定血清及肝臟組織游離脂肪酸(FFA)含量；石蠟切片-HE染色及冰凍切片-蘇丹Ⅲ染色光鏡檢測肝細胞脂質(zhì)沉積；石蠟切片-HE染色光鏡檢測脂肪細胞脂質(zhì)沉積。
　　 結(jié)果: 1、IUGR組仔鼠平均出生體重(5.59±0.55g)明顯低于對照組(6.95±0.64g)(P0.001)；IUGR組仔鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩的發(fā)生率(76.09%)明顯高于對照組(3.49%)(P0.001)；而兩組孕鼠

8、的平均每窩產(chǎn)仔數(shù)及仔鼠圍生期死亡率均無明顯差異。 2、7d及2m齡時,IUGR組仔鼠平均體重低于對照組(P=0.005,P=0.005)；21d及3m齡時,兩組仔鼠平均體重無明顯差異。 3、1d、7d、21d及2m齡時,兩組仔鼠血清TG及FFA水平均無明顯差異；3m齡時,IUGR組仔鼠血清TG及FFA水平均明顯高于對照組(P0.05)。 4、1d、7d及2m齡時,IUGR組仔鼠肝臟重量明顯低于對照組(P0.05)；21d及3m齡時,IU

9、GR組仔鼠肝臟重量與對照組比較無明顯差異；各個時間點,兩組仔鼠肝臟重量與體重比值的比較差異均無統(tǒng)計學意義。 5、1d、7d、21d及2m齡時,兩組仔鼠肝臟組織TG及FFA含量均無明顯差異；3m齡時,IUGR組仔鼠肝臟組織TG及FFA含量均明顯高于對照組(P0.05) 6、各個時間點IUGR組仔鼠肝臟組織肝索及部分肝細胞排列欠規(guī)則；3m齡時,IUGR組仔鼠與對照組比較,肝細胞輕度增大,部分肝細胞出現(xiàn)了脂肪變性； 7、隨著日齡增大,IUGR

10、組及對照組仔鼠白色脂肪細胞及棕色脂肪細胞脂質(zhì)沉積逐漸增多,棕色脂肪細胞逐漸被白色脂肪細胞替代,而且3m齡時,IUGR組仔鼠這種變化更為明顯,白色脂肪組織小型脂肪細胞數(shù)目減少。
　　 結(jié)論: 1、大鼠母孕期全程10%低蛋白飲食是一種有效的建立IUGR動物模型的方法。 2、IUGR大鼠在生后發(fā)育期體重及肝臟重量均出現(xiàn)階段性生長追趕。 3、IUGR大鼠成年期出現(xiàn)血脂水平升高。 4、IUGR大鼠生后發(fā)育期出現(xiàn)肝臟組織及脂肪組織結(jié)構(gòu)異常,

11、肝臟組織脂質(zhì)含量增加,伴有部分肝細胞脂肪變性。
　　 第二部分IUGR大鼠發(fā)生高脂血癥的機制研究
　　 目的: (1)探討肝臟組織PPARa及其調(diào)控的肝細胞脂肪酸β一氧化在IUGR大鼠成年期高脂血癥發(fā)生中的作用。 (2)探討白色脂肪組織PPARy及其介導的脂肪細胞分化在IUGR大鼠成年期高脂血癥發(fā)生中的作用。 (3)探討循環(huán)中脂肪細胞因子用于IUGR大鼠成年期高脂血癥早期預測的可行性。
　　 方法: 采用前期研究

12、建立的IUGR仔鼠模型,以正常仔鼠作為對照組,1d、7d、21d、2m及3m齡留取仔鼠的血清、肝臟組織和白色脂肪組織(WAT)。每組每個時間點的樣本量為8個。采用免疫組化測定肝臟組織PPARa蛋白的表達水平；Western blot測定肝臟組織PPARa蛋白及WAT PPARy蛋白的表達水平；Real-time RT-PCR測定肝臟組織PPARα、Cptla、Acoxl及Acox3和WAT PPARγ、LPL及AFABP mRNA的表達

13、水平；ELISA法測定血清中瘦素、脂聯(lián)素及AFABP水平。
　　 結(jié)果: 1、PPARα蛋白主要表達在肝細胞胞漿,1d、7d、21d、2m及3m齡時,IUGR組仔鼠肝臟組織PPARα蛋白的相對表達量均顯著低于對照組(P0.01)；PPARα mRNA的表達水平較對照組分別下降了35%(P=0.014)、30%(P=0.012)、49%(P=0.032)、54%(P=0.002)及62%(P0.001)。 2、1d、7d、21d、

14、2m及3m齡時,IUGR組仔鼠肝臟組織Cptla mRNA的表達水平較對照組分別下降了55%(P0.001)、47%(P=0.008)、51%(P=0.014)、37%(P=0.011)及55%(P0.001)。 3、1d、7d及2m齡時,兩組仔鼠的Acoxl mRNA的表達水平無明顯差異；21d齡時,IUGR組仔鼠的Acoxl mRNA的表達水平與對照組比較下降了33%(P=0.036)；3m齡,IUGR組仔鼠Acoxl mRNA的表

15、達水平顯著低于對照組(P=0.009)。 4、1d齡時,兩組仔鼠肝臟組織Acox3mRNA的表達水平無明顯差異；自7d齡開始,IUGR組仔鼠肝臟組織Acox3mRNA的表達水平較對照組分別下降了31%(P=0.018)、50%(P=0.022)、37%(P=0.018)及46%(P=0.012)。 5、7d、21d、2m及3m齡時,IUGR組仔鼠白色脂肪組織PPARγ蛋白相對表達量均明顯低于對照組(P0.01)；PPARγ mRNA的表

16、達水平較對照組分別下降了30%(P=0.027)、48%(P=0.001)、45%(P=0.002)及56%(P0.001)。 6、7d、2m及3m齡時,兩組仔鼠WAT LPL mRNA的表達水平均無明顯差異；21d齡時,IUGR組仔鼠WAT LPL mRNA的表達水平低于對照組(P=0.038)。 7、7d齡時,兩組仔鼠白色脂肪組織AFABP mRNA的表達水平無明顯差異；21d、2m及3m齡時,IUGR組仔鼠WAT AFABP mR

17、NA的表達水平較對照組升高了43%(P=0.015)、34%(P=0.033)及73%(P=0.006)。 8、1d齡時,兩組仔鼠血清瘦素水平無明顯差異；自7d齡開時,IUGR組仔鼠血清瘦素水平均顯著高于對照組(P0.01)。 9、1d及7d齡時,兩組仔鼠血清脂聯(lián)素水平無明顯差異；21d、2m及3m齡時,IUGR組仔鼠血清脂聯(lián)素水平均明顯低于對照組(P0.05)。 10、1d及7d齡時,兩組仔鼠血清AFABP水平無明顯差異；21d、2m

18、及3m齡時,IUGR組仔鼠血清AFABP水平均明顯高于對照組(P0.05)。
　　 結(jié)論: 1、IUGR大鼠生后發(fā)育期肝臟組織PPARα表達降低,下調(diào)下游脂肪酸代謝關(guān)鍵靶基因Cpt1a、Acox1及Acox3的表達水平,從而導致線粒體和過氧化物酶體脂肪酸氧化能力降低,可能參與了IUGR個體成年期高脂血癥的發(fā)生。 2、IUGR大鼠白色脂肪組織PPARγ表達低下,導致脂肪細胞分化異常,可能是IUGR個體成年期高脂血癥的發(fā)生原因之一。

19、 3、IUGR大鼠生后發(fā)育期出現(xiàn)高瘦素血癥、低脂聯(lián)素血癥及高AFABP血癥,并且循環(huán)中這些因子的變化早于血脂的改變,循環(huán)中瘦素、脂聯(lián)素及AFABP水平的監(jiān)測有望成為IUGR個體成年期高脂血癥的早期預測因子。
　　 第三部分共軛亞油酸干預對IUGR大鼠高脂血癥的影響及機制研究
　　 目的: 探討共軛亞油酸早期防治IUGR大鼠成年期高脂血癥的可行性。
　　 方法: 采用前期研究建立的IUGR仔鼠模型,以正常仔鼠作為對

20、照組,21d齡斷乳后對照組及IUGR組仔鼠分別進入對照組或者對照+CLA組和IUGR組或者IUGR+CLA組,對照組及IUGR組仔鼠予以正常飼料喂養(yǎng)至3m齡,對照+CLA組及IUGR+CLA組仔鼠予以含2%共軛亞油酸(CLA)的干預飼料喂養(yǎng)至3m齡。留取2m及3m齡仔鼠的血清、肝臟組織及白色脂肪組織。每組每個時間點的樣本量為8個。采用氧化酶法測定血清及肝臟組織甘油三酯(TG)含量；銅顯色法測定血清及肝臟組織游離脂肪酸(FFA)含量；We

21、stern blot測定肝臟組織PPARa蛋白及白色脂肪組織PPARy蛋白的表達水平；Real-time RT-PCR測定肝臟組織PPARα、Cpt1a、Acox1及Acox3和WAT PPARy及LPLmRNA的表達水平；ELISA法測定血清中瘦素、脂聯(lián)素及AFABP水平。
　　 結(jié)果: 1、2m齡時,IUGR+CLA組與IUGR組仔鼠體重明顯低于對照組仔鼠(P0.01),而兩組之間比較無明顯差異；3m齡時,IUGR+CLA組

22、仔鼠體重明顯低于對照組及IUGR組(P0.05)。 2、2m齡時,四組仔鼠血清甘油三酯水平之間均無明顯差異；3m齡時,IUGR+CLA組仔鼠血清TG水平低于IUGR組仔鼠(P0.05),與對照組仔鼠比較無明顯差異；2m及3m齡時,IUGR+CLA仔鼠與對照組及IUGR組比較血清FFA水平均無明顯差異。 3、2m齡,四組仔鼠肝臟組織甘油三酯及游離脂肪酸含量均無明顯差異；3m齡時,IUGR+CLA組仔鼠肝臟組織TG及FFA含量均明顯低于IU

23、GR組(P0.05),與對照組比較無明顯差異。 4、2m及3m齡時,IUGR+CLA組仔鼠肝臟組織PPARα蛋白表達水平均明顯高于IUGR組(P0.05)；2m齡時,IUGR+CLA組仔鼠肝臟組織PPAR α mRNA的表達水平低于對照組(P0.05),而與IUGR組比較無明顯差異；2m齡時,IUGR+CLA組仔鼠肝臟組織Cpt1a、 Acox1及Acox3mRNA的表達水平與對照組及IUGR組比較均無明顯差異；3m齡時,IUGR+CL

24、A組仔鼠肝臟組織PPARα、Cpt1a、Acoxl及Acox3mRNA的表達水平較IUGR組分別上升了37%(P0.01)、43%(P0.05)、44%(P0.01)及36%(P0.01),與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義。 5、2m及3m齡時,IUGR+CLA組仔鼠白色脂肪組織PPARγ蛋白表達水平均明顯高于IUGR組(P0.05),但仍低于對照組(P0.05)；2m齡時,IUGR+CLA組仔鼠WAT PPARγ mRNA表達水平與對照

25、組及IUGR組比較均無差異；3m齡時,IUGR+CLA組仔鼠WAT PPAR Y mRNA表達水平低于對照組(P0.05),但較IUGR組升高了30% (P0.05)；2m及3m齡時,四組仔鼠WAT LPL mRNA的表達差異均無統(tǒng)計學意義。 6、2m及3m齡時,IUGR+CLA組仔鼠血清瘦素水平明顯低于IUGR組(P0.05)；2m齡時,四組仔鼠血清脂聯(lián)素水平比較無明顯差異；3m齡時,IUGR+CLA組仔鼠血清脂聯(lián)素水平顯著高于IUG

26、R組(P0.01),與對照組比較無明顯差異。2m齡時,IUGR+CLA組仔鼠血清AFABP水平顯著低于IUGR組(P0.01),但高于對照組(P0.05)；3m齡時,IUGR+CLA組顯著低于IUGR組(P0.01),與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。 7、CLA干預對正常仔鼠的影響：2m齡時,對照+CLA組仔鼠血清瘦素水平明顯低于對照組(P0.05)；3m齡時,兩組比較無明顯差異；3m齡時,對照+CLA組仔鼠血清AFABP水平顯著低于對照

27、組(P0.01)；其余指標的比較差異均無統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論: 1、共軛亞油酸早期干預可以減輕IUGR大鼠成年期體重,降低其成年期血清甘油三酯水平,并減少其肝臟組織甘油三酯及游離脂肪酸含量。 2、CLA可能通過誘導IUGR大鼠肝臟組織PPARα基因的表達及增強其活性,上調(diào)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而改善其肝細胞游離脂肪酸的β-氧化活性,發(fā)揮降低血脂、減少肝臟脂質(zhì)含量的作用。 3、CLA可能通過誘導IUGR大鼠白色脂肪組織PPARγ