天然及靶向設計小分子化合物抗非小細胞肺癌活性和機制研究.pdf

1、本論文對若干來源于植物及靶向設計組合化學庫內小分子，抗NSCLC活性和機制進行研究，以期找到潛在的更具特異性且效果更好的活性小分子。
　　 第一部分：補骨脂酚對人非小細胞肺癌A549細胞株增殖抑制作用及機制研究
　　 天然來源小分子白藜蘆醇（Resveratrol，3,4,5-trihydroxystilbene）是一種很有前景的抗癌藥物。白黎蘆醇能抑制人類NSCLC細胞增殖，促進細胞凋亡及壞死。補骨脂酚(Bakuchi

2、ol)和白藜蘆醇的結構相似，兩個化合物都具有“(4-羥苯基)-乙烯基(4-hydroxystyryl moiety)”，且均具有抑制DNA聚合酶的作用，該作用可能與兩者結構的相似性有關，因此補骨脂酚也極有可能具有抗NSCLC活性。本部分通過對NSCLC A549細胞株增殖、周期變化、胞內活性氧生成、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,△ψm）變化、細胞凋亡/壞死情況、及相關蛋白表達水平變化等一

3、系列研究，旨在探索補骨脂酚抑制A549增殖活性及其相關機制，并與白藜蘆醇進行平行比較。
　　 本研究采用MTT法檢測補骨脂酚和白藜蘆醇對A549細胞體外細胞毒性；用H2-DCFDA染色-流式細胞術（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細胞內活性氧生成；用JC-1染色-FCM檢測線粒體△ψm變化。用Annexin V/PI雙染-FCM、AO/EB染色檢測細胞凋亡情況。用PI染色-FCM檢測細胞周期變化。用Western-Bl

4、otting法檢測相關蛋白表達水平變化。
　　 實驗結果顯示，補骨脂酚具有抑制A549細胞增殖活性，作用強于白藜蘆醇，補骨脂酚和白藜蘆醇作用72h的IC50分別為9.58±1.12μmol/l和33.02±2.35μmol/1。補骨脂酚作用1h后細胞內ROS顯著增加；引起線粒體△ψm下降，該作用呈量效與時效依賴性，且強于白藜蘆醇。補骨脂酚處理36h引起細胞凋亡，而白藜蘆醇則以引起細胞壞死為主。補骨脂酚處理48 h后，采用AO/E

5、B進行染色并用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)部分凋亡細胞，核固縮且呈現(xiàn)明亮的紅色，呈現(xiàn)明顯的量效關系，該作用強于白藜蘆醇。此外，周期分布實驗表明，補骨脂酚處理24h引起A549細胞S期阻滯。Western-Blotting結果表明其引起細胞p53、Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達水平下調，出現(xiàn)Caspase3裂解片段。
　　 本實驗結果提示，(1)補骨脂酚具有抑制人非小細胞肺癌A549細胞株增殖活性，該作用與經由線粒體依賴通路誘

6、導細胞凋亡，并使細胞周期阻滯相關。(2)補骨脂酚抑制增殖作用明顯強于白藜蘆醇；其中呈現(xiàn)其特有的誘導ROS-線粒體依賴通路凋亡，可能是兩者作用強弱差異的主要機制。
　　 第二部分：8-芳胺基-3H咪唑[4,5-g]喹唑啉類衍生物B-2對人非小細胞肺癌A549細胞株體內外抗腫瘤活性及相關機制
　　 喹唑啉(quinazoline)雜環(huán)是醫(yī)藥化合物中非常重要的核心結構，喹唑啉類衍生物具有重要的生理活性。靶向設計2,3-二取代-

7、8-芳胺基-3H-咪唑[4,5-g]喹唑啉類化合物，通過組合化學構建小分子化合物庫，發(fā)現(xiàn)新型EGFR酪氨酸磷酸激酶抑制劑是一種嶄新的方向。本課題組前期從該化合物庫大量具有分子結構多樣性化合物中，篩選得到若干抗NSCLC活性化合物[23，24]。其中2-Isopropyl-3-butyl-8-(4-fluorophenylamino)-3H-imidazo[4,5-g]quinazoline(B-2)對人非小細胞肺癌A549細胞株具有最佳

8、增殖抑制活性。本研究第二部分考察了B-2對該細胞株體內外抗腫瘤活性和相關作用機制。
　　 本實驗首先采用MTT法檢測B-2體外對腫瘤細胞和非腫瘤細胞增殖抑制活性。為闡明上述體外抑制增殖作用是否可在體內重現(xiàn)，本研究采用中空纖維內置腫瘤細胞模型，植入實體瘤A549和白血病K562兩種不同的細胞株（除了考察體內藥物是否分布到達靶部位外，尚評價對A549的選擇性抑制作用），給裸鼠口服25、50、100mg/kg的B-2和100mg/kg

9、 Iressa（為臨床推薦劑量的2.67倍，按體表面積折算），初步探索B-2對裸鼠皮下埋植中空管中細胞增殖抑制活性。之后采用裸小鼠皮下移植瘤模型，評價B-2對荷A549細胞裸小鼠實驗治療作用。并采用計算機輔助受體一配體對接實驗、體外激酶活性測試B-2對EGFR酪氨酸激酶活性影響。最后對B-2作用機制進行研究。用PI染色-FCM檢測B-2對A549細胞周期分布的影響。用JC-1染色-FCM檢測該化合物作用后線粒體△ψm變化情況。用Anne

10、xinV/PI雙染-FCM檢測B-2誘導的細胞凋亡。用AO/EB染色觀察細胞核損傷情況。用Western-Blotting法檢測A549細胞周期和凋亡相關蛋白表達變化。
　　 實驗結果顯示，B-2化合物對A549細胞具有較強體外增殖抑制活性，48hIC50為4.30±0.33μmol/L。而對非腫瘤來源的細胞EA.hy926和MEF則未呈現(xiàn)明顯的抑制增殖作用。中空纖維模型實驗中，B-2裸小鼠經口給藥，結果發(fā)現(xiàn)，化合物B-2特異性

11、地抑制了管內A549細胞的生長，并體現(xiàn)了良好的量效關系，其作用強于Iressa。25、50、100mg/kg B-2對A549細胞抑制率分別為38.45±2.94％、60.43±1.86％、65.83±2.46％，而100mg/kg Iressa對A549細胞抑制率為47.05±1.15％，但對體重影響不明顯。荷A549細胞裸小鼠模型實驗中，給藥三周后，各組均無一動物死亡，與陰性對照組比較，B-250、100、150mg/kg以及Ire

12、ssa100mg/kg組的小鼠體重無顯著變化。B-250、100、150mg/kg組抑瘤率分別為48.69％、85.50％和86.45％，均大于40％，Iressa 100mg/kg組抑瘤率為67.52％，也大于40％。中劑量組B-2100mg/kg抑瘤作用就顯著優(yōu)于Iressa100mg/kg。
　　 B-2對EGFR酪氨酸激酶活性抑制結果表明，B-2與Iressa的EGFR IC50分別為0.067、0.042μmol/L。

13、計算機輔助進行EGFR蛋白-配基對接實驗結果表明，B-2與EGFR具有較好匹配能力，但對接得分弱于Iressa。這與B-2對EGFR酪氨酸激酶活性抑制能力弱于Iressa的結果相吻合。機制研究結果表明，B-2處理24h引起細胞G1期阻滯，后續(xù)Western-Blotting結果表明B-2誘導的G1期阻滯與下調CyclinD1、CDK4，上調p53、p27kipl、Rb的蛋白表達水平相關。B-2處理6h即引起A549線粒體△ψm下降，具有

14、量效依賴關系，提示細胞啟動了凋亡程序。B-2處理36h用AnnexinV/PI雙染-FCM檢測l、5、25μmol/LB-2細胞凋亡率分別為6.79±1.11％、14.58±3.53％、50.25±11.34％。B-2處理48h采用AO/EB進行染色并用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)凋亡細胞，核固縮且呈現(xiàn)明亮的紅色，呈現(xiàn)明顯的量效關系。后續(xù)Western-Blotting結果表明B-2上調Bax/Bcl-2比值，引起細胞色素C大量釋放和cas

15、pase9/3激活。提示B-2介導了A549線粒體△ψm下降觸發(fā)的線粒體功能喪失、Bax/Bcl-2比值變化、線粒體細胞色素C釋放、caspase活化，最終引起凋亡。
　　 本研究結果提示，喹唑啉雜環(huán)化合物B-2具有體外選擇性抑制人非小細胞肺癌A549增殖作用，作用強于市售同類產品Iressa，但對非腫瘤細胞增殖抑制作用不明顯。B-2裸小鼠經口給藥，對中空纖維管內A549具有選擇性抑制增殖作用；對荷A549細胞裸小鼠具有顯著實驗

16、治療作用，作用強于Iressa，但對體重影響不明顯。B-2的抗腫瘤作用并非單純是通過阻斷EGFR酪氨酸激酶活性，尚與誘導細胞周期G1期阻滯、促凋亡相關。
　　 全文結論：
　　 1.補骨脂酚具有抑制人非小細胞肺癌A549細胞株增殖活性，該作用與經由線粒體依賴通路誘導細胞凋亡，并使細胞周期阻滯相關。補骨脂酚抑制增殖作用明顯強于白藜蘆醇；其中呈現(xiàn)其特有的誘導ROS-線粒體依賴通路凋亡，可能是兩者作用強弱差異的主要機制。