納米銀-小腸黏膜下層修復(fù)腹壁缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:腹壁疝，戰(zhàn)創(chuàng)傷、腫瘤等病變?cè)斐傻母贡谌睋p以及救治腹腔間隙綜合征等危重病時(shí)，均需使用腹壁修復(fù)重建材料，臨床上對(duì)此存在著巨大的需求。理想的腹壁修復(fù)重建材料應(yīng)理化性質(zhì)穩(wěn)定、安全無毒無致癌性、耐張力優(yōu)于腹壁組織、耐機(jī)械疲勞、組織相容性好、排異反應(yīng)小、利于組織再生、來源及使用方便；此外最新的觀點(diǎn)更強(qiáng)調(diào)材料具有抗感染性、柔軟和服帖性以及能獲得最小的手術(shù)痛苦以及相對(duì)最小的補(bǔ)片植入量等。但目前國內(nèi)外公認(rèn)尚未找到一種完全理想修復(fù)材料。我國人工材料疝

2、修復(fù)術(shù)普及率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于西方發(fā)達(dá)國家，原因一方面是基層醫(yī)院醫(yī)療技術(shù)更新速度慢，另一方面是手術(shù)中使用的修補(bǔ)材料在我國還沒有產(chǎn)業(yè)化，全部依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴。僅就我國的人口基數(shù)和美國的人口基數(shù)以及疝氣的發(fā)病率來比較，不難看出腹壁修復(fù)重建材料在我國的巨大的潛在經(jīng)濟(jì)意義和應(yīng)用價(jià)值前景。
　　 生物材料是當(dāng)下國外疝和腹壁外科研究的最新進(jìn)展，包括動(dòng)物源性材料如豬小腸粘膜下層(small intestinal submucosa，SIS)、牛心包等

3、；人尸源性材料如人工脫細(xì)胞真皮(acellular dermal matrix，ADM)等。總體評(píng)價(jià)[7]，生物材料除了擁有與合成材料一樣的低疝復(fù)發(fā)率，在生物相容性、抗粘連性等方面也較人工合成材料更為理想，術(shù)后疝復(fù)發(fā)、感染，腸梗阻、瘺管形成等不良反應(yīng)的發(fā)生率明顯較低。
　　 值得重視的是，生物材料的抗微生物活性優(yōu)于合成材料。研究發(fā)現(xiàn)[8]，醋酸消化制備的SIS細(xì)胞外基質(zhì)浸出液具有抑制革蘭陰性大腸桿菌和革蘭陽性金黃色葡萄球菌的作用

4、。SIS在有金黃色葡萄球菌定植時(shí)亦可實(shí)現(xiàn)良好的組織再塑，植入SIS傷口的感染性低于合成材料[9]。但同時(shí)國外將生物材料試用于腹壁缺損修復(fù)或重建的初期臨床經(jīng)驗(yàn)也表明，修復(fù)污染或潛在感染的腹壁缺損失敗率＞50％，并且依賴于傷口感染的類型和再血管化速度。因此，提高腹壁修復(fù)材料的抗感染性仍是疝和腹壁外科的巨大挑戰(zhàn)。
　　 在抗菌劑方面，銀作為抗菌劑，具有高效、安全無毒、抗菌譜廣、無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，能殺滅細(xì)菌、真菌和霉菌甚至病毒。銀殺菌機(jī)制

5、主要與銀離子有關(guān)，銀離子可與細(xì)菌內(nèi)巰基酶結(jié)合從而使后者失活，阻斷微生物的能量代謝及細(xì)胞壁合成，起到殺滅細(xì)菌、病毒及真核微生物的作用。也有研究表明納米銀顆?？梢院筒≡w的DNA堿基結(jié)合，形成交叉鏈接，置換嘌呤和嘧啶中相鄰氮之間的氫鍵，使DNA變性，不能復(fù)制，致細(xì)菌失活。此外，銀還有促進(jìn)傷口愈合的功能。研究發(fā)現(xiàn)，傷口局部涂抹銀乳膏可抑制變應(yīng)性接觸性皮炎鼠模型炎癥因子表達(dá)、誘導(dǎo)炎性細(xì)胞調(diào)亡。動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用均證實(shí)銀殺菌劑屬實(shí)際無毒級(jí)。近

6、年來，利用納米技術(shù)將金屬銀加工成納米級(jí)的銀微粒后，其表面積極大，顯示明顯的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng)，抗菌活性大大增強(qiáng)，效力更持久，安全性更高。納米銀作為抗菌材料已應(yīng)用于醫(yī)用導(dǎo)管、內(nèi)固定器械、創(chuàng)傷敷料等方面。我們從中得到啟發(fā)，利用生物材料的三維網(wǎng)狀超微結(jié)構(gòu)、主要成分為膠原蛋白(90％為Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維)易于粒子粘附，植入粒徑15nm左右的納米銀粒子形成具有抗菌性的生物材料。植入體內(nèi)后隨著生物材料的降解銀微粒逐步釋放，從而持久發(fā)

7、揮抗細(xì)菌定植和抗感染、利于宿主細(xì)胞浸潤(rùn)生長(zhǎng)和血管再生的作用。
　　 綜合上述，構(gòu)建理想的新型抗菌生物—高分子復(fù)合腹壁修復(fù)材料的條件已經(jīng)成熟，如有望構(gòu)建成功，將為臨床腹壁缺損及疝的治療提供新的選擇。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前國內(nèi)外尚未見復(fù)合生物材料和合成材料構(gòu)建腹壁補(bǔ)片的報(bào)道。
　　 材料和方法:
　　 第一部分：抗菌生物—高分子復(fù)合腹壁修復(fù)材料的構(gòu)建
　　 1.按Abraham方法制備豬小腸粘膜下層(SIS)。

8、r>　　 2.通過自組裝技術(shù)將納米銀粒子植入SIS構(gòu)建抗菌生物材料納米銀SIS。
　　 3.采用掃描電鏡觀察材料超微結(jié)構(gòu)，瓊脂彌散法測(cè)試復(fù)合材料的體外抗菌能力。
　　 第二部分：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及免疫研究
　　 1.采用復(fù)合材料、生物材料、合成材料分別修復(fù)大鼠全層腹壁缺損(3×3cm)，每組12只F344成年大鼠(體重約200g)，并用10^4cfu/ml的金黃色葡萄球菌污染修復(fù)區(qū)。修復(fù)后1d、3d、5d、7d取動(dòng)物腹

9、壁分泌物作細(xì)菌培養(yǎng)，1d、3d、5d、7d、15d、30d取動(dòng)物血采用火焰原子吸收光譜法檢測(cè)血液中銀含量。修復(fù)后2月處死動(dòng)物，腹壁注水試驗(yàn)檢測(cè)修復(fù)區(qū)抗壓情況，使用HE和甲苯胺藍(lán)染色、掃描電鏡觀察修復(fù)區(qū)邊緣及中央的組織結(jié)構(gòu)、血管化程度，取動(dòng)物腦、肝、腎組織，采用火焰原子吸收光譜檢測(cè)組織中銀含量。
　　 2.SD大鼠30只，體重200～250g，手術(shù)造成3 cm×2 cm全層腹壁缺損，隨機(jī)分為三組(n=10)，分別采用相同面積的納米

10、銀豬小腸黏膜下層(NS-SIS)，單純豬小腸黏膜下層(SIS)和Proceed(R)補(bǔ)片進(jìn)行修補(bǔ)。術(shù)后4周和8周取出腹壁修復(fù)材料，進(jìn)行CD3(淋巴細(xì)胞)，CD68(巨噬細(xì)胞)及CD31(血管內(nèi)皮)免疫組化分析。
　　 第三部分：材料的生物安全性試驗(yàn)
　　 1.進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，將復(fù)合材料放入96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)板分3組(復(fù)合材料、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照)，每組12孔，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液2mL,置入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，24h后取

11、出備用。將已培養(yǎng)48 h生長(zhǎng)旺盛的L929細(xì)胞計(jì)算出細(xì)胞密度(細(xì)胞數(shù)/mL)：配制成4×104/mL的細(xì)胞懸液，取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入細(xì)胞懸液0.5 mL，置37℃培養(yǎng)。于培養(yǎng)后的第1，2，4，7 d，每組各取3孔進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　 2.進(jìn)行皮膚刺激試驗(yàn)，于成年家兔皮內(nèi)注射復(fù)合材料浸出液及對(duì)照液(生理鹽水)各0.2 mL，于注射后15 min，1 h，2 d，3 d觀察實(shí)驗(yàn)區(qū)皮膚反應(yīng)。
　　 3.

12、進(jìn)行皮膚致敏試驗(yàn)，于豚鼠背部脫毛區(qū)涂0.1mL復(fù)合材料浸出液和對(duì)照液(生理鹽水)各0.1mL，連續(xù)觀察3d，記錄試驗(yàn)區(qū)皮膚組織反應(yīng)。
　　 4.進(jìn)行致熱原試驗(yàn)：于成年家兔耳緣靜脈注射復(fù)合材料浸出液及對(duì)照液(生理鹽水)各0.1 mL，于注射后1h，6h，12h，24h，48h，72h分別測(cè)量家兔體溫。
　　 5.數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P值＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

13、r>　　 結(jié)果:
　　 一、對(duì)納米銀-小腸黏膜下層修復(fù)材料(NS-SIS)的體外抗菌效果進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明納米銀-小腸黏膜下層修復(fù)材料具有良好的體外抗菌效果。
　　 二、納米銀-小腸黏膜下層修復(fù)材料能夠用于修復(fù)大鼠污染腹壁缺損，且傷口感染率低于單純生物腹壁修復(fù)材料(SIS)和合成材料(Proceed(R)補(bǔ)片)。
　　 三、對(duì)納米銀復(fù)合生物腹壁修復(fù)材料的修復(fù)大鼠腹壁缺損后對(duì)修復(fù)區(qū)局部炎癥反應(yīng)和微血管密度的

14、影響進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明納米銀-小腸黏膜下層修復(fù)材料與單純生物腹壁修復(fù)材料對(duì)修復(fù)區(qū)局部炎癥反應(yīng)及微血管密度的作用相同，兩者較合成材料局部炎癥反應(yīng)輕，微血管密度較合成材料低。
　　 四、對(duì)納米銀復(fù)合生物腹壁修復(fù)材料的生物安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，結(jié)果表明納米銀-小腸黏膜下層修復(fù)材料(NS-SIS)的生物安全性良好。
　　 結(jié)論:
　　 納米銀-小腸黏膜下層修復(fù)材料(NS-SIS)有較好的抗菌效果，且傷口感染率和局部