氧化應(yīng)激性DNA損傷精子受精后受精卵修復(fù)與沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)抗氧化保護(hù)作用的研究.pdf

1、前言
　　DNA雙鏈斷裂(DNAdouble-strandedbreaks,DSBs)發(fā)生后,哺乳動物細(xì)胞將啟動一個復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)對其進(jìn)行監(jiān)控及修復(fù):包括細(xì)胞周期檢驗點、DNA損傷修復(fù)及凋亡。DNA損傷反應(yīng)是高度保守的信號感應(yīng)過程,大致可分為損傷感應(yīng)、信號傳遞及信號效應(yīng)3個部分。損傷感應(yīng)分子3-磷脂酰肌醇激酶(Phosphoinositide3-kinaserelatedproteinkinase,PI-3K)家族成員針對不同的損

2、傷來源被激活后,迅速聚集到損傷位點,快速磷酸化下游的效應(yīng)激酶,通過協(xié)同作用實現(xiàn)對DNA損傷的高度協(xié)調(diào)反應(yīng)。H2AX作為PI-3K家族成員的下游分子,其第139位絲氨酸殘基被快速磷酸化后形成γH2AX。后者被認(rèn)為是DNA損傷修復(fù)標(biāo)志物,而ATM所具有的可被DNA損傷相關(guān)的染色質(zhì)修飾所激活的能力,使其成為PI-3K家族中促使H2AX磷酸化最匹配的激酶。同時,ATM也參與了細(xì)胞周期檢驗點的調(diào)控:激活的ATM磷酸化細(xì)胞周期檢驗點激酶Chk1或C

3、hk2,激活的Chk1/Chk2進(jìn)而順序磷酸化不同的效應(yīng)因子,并根據(jù)DNA的損傷類型,形成不同的信號通路激活細(xì)胞周期檢驗點(G1/S、S、G2/M),使細(xì)胞周期停滯,為DNA損傷修復(fù)提供時間。
　　精液冷凍保存是輔助生殖技術(shù)(Assistedreproductivetechnology,ART)領(lǐng)域中的重要技術(shù),其凍融過程產(chǎn)生過量的活性氧類物質(zhì)(Reactiveoxygenspecies,ROS)可致精子氧化應(yīng)激性DNA損傷。AR

4、T應(yīng)用又使DNA損傷精子受精發(fā)育成胚胎的機(jī)會增加,尤其是卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(Intra-cytoplasmicsperminjection,ICSI),由于避開了自然受精過程中多種天然屏障對精子的篩選,增加了DNA損傷精子直接進(jìn)入卵子的風(fēng)險。DNA損傷精子仍可受精,但成熟精子喪失自我修復(fù)DNA損傷的能力,需依賴受精后受精卵內(nèi)的修復(fù)。而目前關(guān)于氧化應(yīng)激性DNA損傷精子受精后受精卵修復(fù)的研究十分有限,進(jìn)行該方向的研究為完善DNA損傷精

5、子受精后受精卵修復(fù)理論無疑具有重大意義。
　　正是由于精子氧化應(yīng)激性DNA損傷與ROS密切相關(guān),在ART體系中添加抗氧化保護(hù)劑以降低ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激性損傷可能是提高ART治療結(jié)局的有效途徑之一。沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)因具有非常強(qiáng)的抗氧化活性,能夠保護(hù)細(xì)胞和DNA免受損害而作為目前眾多抗氧化保護(hù)劑中最理想的一種,被嘗試添加到體外受精培養(yǎng)體系中,表現(xiàn)出促進(jìn)胚胎發(fā)育的

6、作用,但是其對凍融精子受精卵的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。闡明EGCG對氧化應(yīng)激性DNA損傷精子受精后受精卵的保護(hù)機(jī)制,不僅為研究冷凍精子氧化應(yīng)激性DNA損傷防治措施提供理論依據(jù),也為尋找降低DNA損傷精子遺傳風(fēng)險的策略方法提供了新思路。
　　目的
　　1.初步探討氧化應(yīng)激性DNA損傷精子受精后受精卵DNA損傷修復(fù)機(jī)制。
　　2.初步探討EGCG對氧化應(yīng)激性DNA損傷精子受精后受精卵的保護(hù)機(jī)制。
　　方法
　　1.分

7、別將昆明(KunMing,KM)小鼠精子放入新鮮精子獲能液、加1mMH2O2的精子獲能液中,5％CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育1.5小時左右,得到新鮮精子和氧化應(yīng)激性DNA損傷精子,調(diào)整精子濃度為1-2.5×106個/ml,分別進(jìn)行體外受精獲得正常對照組及氧化應(yīng)激性DNA損傷組受精卵。采用免疫熒光法檢測正常對照組及氧化應(yīng)激性DNA損傷組原核期胚胎中pSer1981-ATM、pSer345-Chk1及pThr68-Chk2焦點的形成并進(jìn)行比較。

8、
　　2.依據(jù)受精液和胚胎培養(yǎng)液中是否添加EGCG,將氧化應(yīng)激性DNA損傷組受精卵分兩組:未添加組受精液和胚胎培養(yǎng)液中未添加EGCG;添加組受精液和胚胎培養(yǎng)液中均添加了17.5μg/mlEGCG。從受精后16.5小時至23.5小時,分別對未添加組及添加組的受精率、二細(xì)胞形成情況及四細(xì)胞形成情況進(jìn)行觀察,每小時觀察1次,計算受精率、一細(xì)胞卵裂率及二細(xì)胞卵裂率并進(jìn)行比較;選擇未添加組及添加組上述各觀察時間點的受精卵,免疫熒光法檢測pS

9、er1981-ATM焦點的形成并進(jìn)行比較。
　　結(jié)果
　　1.免疫熒光法檢測各組受精卵中pSer1981-ATM信號,發(fā)現(xiàn)正常對照組受精卵中pSer1981-ATM、pSer345-Chk1及pThr68-Chk2均無信號;氧化應(yīng)激性DNA損傷組中可見較強(qiáng)的pSer1981-ATM熒光信號及pSer345-Chk1熒光信號,pThr68-Chk2則未見明顯信號。
　　2.未添加組的受精率、一細(xì)胞卵裂率及二細(xì)胞卵裂率分別

10、為45.2%、100%及61.5%,添加組的受精率、一細(xì)胞卵裂率及二細(xì)胞卵裂率分別為44.5%、97.8%及71.3%,添加組與未添加組相比,受精率、一細(xì)胞卵裂率及二細(xì)胞卵裂率差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。從受精后16.5小時至受精后23.5小時,未添加組的一細(xì)胞卵裂率依次是21%、34%、68%、86%、89%、91%、96%、98%;添加組的一細(xì)胞卵裂率依次是32%、70%、83%、87%、89%、90%、95%、96%;對各

11、個時間點添加組及未添加組的一細(xì)胞卵裂率進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),受精后17.5小時和受精后18.5小時(相當(dāng)于第一次有絲分裂細(xì)胞周期的晚G2期)的一細(xì)胞卵裂率差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其它時間點的一細(xì)胞卵裂率差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。以受精后時間為自變量,一細(xì)胞卵裂率為因變量建立函數(shù),以一細(xì)胞卵裂率為50%的時間點作為觀測點,當(dāng)一細(xì)胞胚胎卵裂率為50%時,未添加組為受精后18.28598小時,添加組為受精后17.10280小時,添加

12、組比未添加組提前約1小時進(jìn)入分裂。未添加組和添加組pSer1981-ATM熒光信號強(qiáng)度分別為0.008327±0.006603和0.0196±0.010347,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論
　　1.氧化應(yīng)激性DNA損傷精子受精后DNA損傷的修復(fù)依賴于卵母細(xì)胞中儲存的mRNA和蛋白質(zhì),可能通過ATM啟動了受精卵DNA損傷修復(fù)機(jī)制的同時,ATM還可能激活Chk1啟動細(xì)胞周期檢驗點,使細(xì)胞分裂發(fā)生延遲,從而為修復(fù)贏