復(fù)方苦參注射液干預(yù)BMSCs與乳腺癌細(xì)胞交互作用機(jī)理的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、流行病學(xué)顯示：在中國(guó)，每年乳腺癌的發(fā)病率增加3％。是世界上癌癥的最高增幅，中國(guó)首個(gè)大規(guī)模乳腺癌流行病調(diào)研項(xiàng)目“中國(guó)乳腺癌流行病學(xué)調(diào)研項(xiàng)目”中國(guó)女性乳腺癌患者的發(fā)病年齡跨度從20歲到70余歲，其中40歲到49歲年齡段是發(fā)病高峰期，發(fā)病的中位年齡為48歲，比西方提早了十年。乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這也是目前乳腺癌治療中的難題之一。然而關(guān)于發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因和機(jī)制卻仍舊很不明晰，同時(shí)這一現(xiàn)狀也提示我們對(duì)于乳腺癌的治療當(dāng)有新的研究角度和方法的提出

2、。
　　在過去的25年中，由于過度夸大的腫瘤遺傳學(xué)-特別是癌基因和抑癌基因的作用，形成了以腫瘤細(xì)胞為中心的概念，腫瘤基質(zhì)細(xì)胞和腫瘤免疫細(xì)胞等被人逐漸忽視，因此不能全面的理解腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征。經(jīng)過十多年的互相質(zhì)疑，腫瘤研究者逐漸形成了一種歷史性的重要的一致性看法，即腫瘤間質(zhì)細(xì)胞為主體及其構(gòu)建的腫瘤炎性微環(huán)境會(huì)激發(fā)并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)腫瘤的炎癥微環(huán)境也積極促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于骨髓的多能干細(xì)胞

3、，在機(jī)體發(fā)生創(chuàng)傷和炎癥時(shí)，該種細(xì)胞受趨化因子的驅(qū)動(dòng)會(huì)趨化到機(jī)體炎性局部，積極參與機(jī)體的修復(fù)。腫瘤被稱為永不停息的炎癥，該類細(xì)胞近年被證實(shí)是腫瘤炎癥微環(huán)境中重要的間質(zhì)細(xì)胞之一，其可通過旁分泌途徑分泌趨化因子并與腫瘤表面的受體結(jié)合，同時(shí)激活下游癌基因通路，導(dǎo)致腫瘤惡性增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移能力的增加，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　在乳腺癌發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時(shí)表現(xiàn)為病情的進(jìn)展，而此時(shí)毒熱壅盛是其進(jìn)展期常見證型之一，同時(shí)也是腫瘤內(nèi)部炎癥微環(huán)境的

4、外在表現(xiàn)，此時(shí)當(dāng)以清熱解毒法來(lái)治療。復(fù)方苦參注射液是常用的具有清熱解毒功效的中藥注射液，我們采用其作為干預(yù)手段，以腫瘤炎癥微環(huán)境中的重要間質(zhì)細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，以調(diào)控其與乳腺癌細(xì)胞交互作用的趨化因子軸線及其下游基因的激活情況為目的，觀察苦參注射液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促乳腺癌惡性行為的干預(yù)作用。本課題研究主要包括如下內(nèi)容。
　　1不同來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外純化、鑒定及多能性比較
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于骨髓的

5、多能干細(xì)胞，可分化為多種組織細(xì)胞類型，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。可經(jīng)體外誘導(dǎo)分化而進(jìn)一步體內(nèi)移植生長(zhǎng)，在組織工程中應(yīng)用廣泛。我們通過文獻(xiàn)綜述，選擇了可獲得良好細(xì)胞活力的差速貼壁發(fā)來(lái)分別從SD大鼠和Ba1b/c小鼠的骨髓中獲取了不同鼠源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過生長(zhǎng)曲線、誘導(dǎo)成骨和成脂分化、流式細(xì)胞術(shù)鑒別細(xì)胞表型來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了鑒定和比較，最終認(rèn)為SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有更好的細(xì)胞活性和多能性，選擇其為下一步實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞來(lái)源。<

6、br>　　2復(fù)方苦參注射液干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中表型分化
　　干細(xì)胞的研究可能治愈臨床近80％的疾病，但就腫瘤和感染性疾病的治療仍就是其治療的盲區(qū)，同時(shí)其在組織工程應(yīng)用中的安全性問題(突變?yōu)槟[瘤細(xì)胞)仍就是其研究領(lǐng)域的重要障礙之一，同時(shí)也為腫瘤干細(xì)胞理論提供了最直接的證據(jù)。因此研究成體干細(xì)胞與腫瘤的關(guān)系是目前國(guó)內(nèi)外研究中的重點(diǎn)之一。近期發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在乳腺癌的發(fā)病、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起到了重要作用，但仍有爭(zhēng)議，研究前沿

7、認(rèn)為腫瘤作為永不停息的炎癥，與機(jī)體損傷后修復(fù)等炎性反應(yīng)等有很大類似，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)受腫瘤炎性趨化因子梯度趨化到腫瘤間質(zhì)中，并在腫瘤炎性微環(huán)境中分化為具有腫瘤成纖維細(xì)胞表型的細(xì)胞，持續(xù)分泌SDF-1等趨化因子，并與腫瘤表面的CXCR4受體結(jié)合，通過旁分泌的途徑激活下游癌基因，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，惡性增殖、血管新生，最終也會(huì)導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。我們通過腫瘤條件培養(yǎng)液來(lái)模擬腫瘤炎性微環(huán)境，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中表型的變化，來(lái)

8、驗(yàn)證以上病理變化的發(fā)生。
　　3復(fù)方苦參注射液對(duì)BMSCs與乳腺癌細(xì)胞間趨化因子軸線影響的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　選取對(duì)于炎癥反應(yīng)具有較好抑制作用，在臨床廣泛應(yīng)用的復(fù)方苦參注射液來(lái)作為干預(yù)手段，以BMSCs與乳腺癌4T1細(xì)胞交互作用的重要趨化因子軸線SDF-1/CXCR4為觀察靶點(diǎn)，在體外分別采用單獨(dú)干預(yù)和Transwell共培養(yǎng)體系來(lái)觀察在兩者交互作用時(shí)SDF-1/CXCR4動(dòng)態(tài)變化。
　　4復(fù)方苦參注射液對(duì)BMSCs促乳

9、腺癌惡性行為影響的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　采用Transwell共培養(yǎng)體系觀察共培養(yǎng)情況下，BMSCs對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞系的增殖的影響，采用Transwell遷徙小室來(lái)觀察；條件培養(yǎng)液和共培養(yǎng)情況下，觀察BMSCs向4T1細(xì)胞遷移情況，采用Transwell侵襲小室來(lái)觀察，條件培養(yǎng)液和共培養(yǎng)情況下，觀察4T1乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的變化。采用了mRNAarray的實(shí)驗(yàn)方法，選取了與腫瘤惡性增殖、侵襲、粘附、凋亡、ECM相關(guān)等惡性行為高度相關(guān)

10、的90個(gè)基因?yàn)闄z測(cè)目標(biāo)，對(duì)苦參對(duì)體系的干預(yù)作用進(jìn)行了初步的研究。
　　結(jié)論:
　　綜上本實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論：
　　1在本實(shí)驗(yàn)室成功建立了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離，純化及鑒定的平臺(tái)，并比較了不同來(lái)源骨髓間充質(zhì)的特性，為實(shí)驗(yàn)的開展提供良好的細(xì)胞來(lái)源。
　　2分別觀察了復(fù)方苦參注射液對(duì)正常骨髓間充質(zhì)細(xì)胞和乳腺癌4T1細(xì)胞在抑制率、誘導(dǎo)凋亡影響的差異性，最終發(fā)現(xiàn)在具有抑制腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的相同濃度下，復(fù)方苦參注射液對(duì)正常的骨

11、髓間充質(zhì)干細(xì)胞并未表現(xiàn)出明顯影響，提示具有此特性的復(fù)方苦參注射液是理想的長(zhǎng)期干預(yù)藥物。同時(shí)和化療藥DDP的對(duì)比也提示我們，復(fù)方苦參注射液在低濃度的干預(yù)條件下可能并不是完全通過對(duì)腫瘤的直接抑制而起到抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用。
　　3在腫瘤微環(huán)境情況下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型發(fā)生了變化，免疫熒光結(jié)果顯示其特異性蛋白表達(dá)量和強(qiáng)度隨著干預(yù)時(shí)間增加而不斷增強(qiáng)。采用復(fù)方苦參注射液干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞表型的變化。

12、>　　4不同濃度苦參注射液干預(yù)后，在常氧和低氧條件下其均可降低乳腺癌4T1細(xì)胞表面CXCR4受體的表達(dá)，同時(shí)在低氧環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促乳腺癌4T1細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于常氧環(huán)境，低氧環(huán)境下骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞向乳腺癌4T1細(xì)胞的遷移能力較常氧環(huán)境增加?？鄥?duì)以上環(huán)節(jié)均有一定的抑制作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在低氧共培養(yǎng)48h條件下，復(fù)方苦參注射液可明顯降低細(xì)胞共培養(yǎng)上清中的SDF-1的濃度，并影響兩者細(xì)胞之間的互相遷移。(P>0.05)
　　5共培養(yǎng)

13、后乳腺癌惡性行為增加，表現(xiàn)在低氧環(huán)境下在BMSCs條件培養(yǎng)液中的增殖能力增強(qiáng)，共培養(yǎng)低氧環(huán)境下侵襲能力增強(qiáng)。采用mRNAarray基因檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)的條件下相關(guān)惡性行為的基因上調(diào)，在基因?qū)用鏋槲覀兘忉屃诉@一行為的可能原因之一。在用復(fù)方苦參注射液干預(yù)后發(fā)現(xiàn)由MDSCs造成的乳腺癌增加的惡性行為表現(xiàn)受到一定程度的抑制，同時(shí)在基因?qū)用嬉脖憩F(xiàn)為相關(guān)基因型受抑制，主要表現(xiàn)在侵襲等惡性行為相關(guān)的基因明顯受抑，雖然也出現(xiàn)了部分癌基因的上調(diào)，但最