臍帶血來源的iNKT細(xì)胞體外培養(yǎng)及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞殺傷作用的研究.pdf

1、乳腺癌是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一。全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代開始逐年升高。尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家，目前已上升至女性死亡原因的第一位。目前腫瘤的治療手段包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等。腫瘤的免疫治療是通過激活人體免疫系統(tǒng)，依靠自身免疫機(jī)能殺滅癌細(xì)胞，是繼手術(shù)、化療和放療后的一種新的腫瘤治療手段，也是治療乳腺癌尤其是三陰乳腺癌一個(gè)極具前景的輔助策略。
　　iNKT細(xì)胞是一類既表達(dá)T細(xì)胞受

2、體又表達(dá)NK細(xì)胞表面標(biāo)志的一組異質(zhì)性淋巴細(xì)胞亞群，在先天固有性免疫和后天適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用。α-半乳糖神經(jīng)酰胺，是一種強(qiáng)有效的iNKT細(xì)胞激活劑，通過CD1d分子提呈和TCR介導(dǎo)的方式激活iNKT細(xì)胞，從而刺激iNKT細(xì)胞的大量增殖活化。活化的iNKT細(xì)胞，既可直接作為抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用，又能通過激活其他免疫效應(yīng)細(xì)胞，間接實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。iNKT細(xì)胞療法是一種新的腫瘤免疫治療方法。
　　目的:
　　本研究擬對(duì)

3、人臍帶血來源iNKT細(xì)胞體外培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，探索高效的體外制備iNKT細(xì)胞的方法。觀察GM-CSF聯(lián)合α-GalCer和IL-2體外制備人臍帶血來源iNKT細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，并觀察其對(duì)不同亞型乳腺癌細(xì)胞體外的殺傷效果。
　　方法:
　　采用加入GM-CSF聯(lián)合α-GalCer和IL-2的方法體外制備iNKT細(xì)胞，與常規(guī)方法（加入α-GalCer和IL-2）進(jìn)行對(duì)比，用只加IL-2作為對(duì)照，觀察制備的單個(gè)核細(xì)胞的增殖情況，采用流式細(xì)胞

4、儀檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中iNKT細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞所占的比例，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的濃度，采用CCK-8法檢測(cè)對(duì)不同亞型乳腺癌細(xì)胞株（MDA-MB-231、MCF-7及AU-565）的殺傷效果。
　　結(jié)果:
　　人臍帶血單個(gè)核細(xì)胞增殖情況:倒置顯微鏡下觀察，3組細(xì)胞在第3天左右開始增殖，第7～14天保持較快的增殖速度。統(tǒng)計(jì)分析表明，兩實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組增殖速度較高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、差異。
　　單個(gè)核細(xì)胞中iNKT細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞所占比例:第0天，人臍帶血單個(gè)核細(xì)胞中iNKT細(xì)胞所占比率較低，僅加入IL-2后并不能增加iNKT細(xì)胞的比率。而兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組加入α-GalCer及不同細(xì)胞因子后均能使iNKT細(xì)胞擴(kuò)增。第7天時(shí)，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中iNKT細(xì)胞所占比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而第14天時(shí)，GM-CSF+α-GalCer+IL-2組的iNKT細(xì)胞所占比例明顯增高，與其他組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。本培

6、養(yǎng)方法中NK細(xì)胞(CD3-CD161+)所占比率，第7天和第14天時(shí)，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，而兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究的培養(yǎng)方法中T細(xì)胞(CD3+)所占比率，第7天和第14天時(shí)，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　培養(yǎng)上清液中IL-4、IFN-γ的濃度:第1天時(shí)，三組IL-4的濃度均較低，而IFN-γ的濃度兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組稍高于對(duì)照組

7、，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第7天時(shí)，IL-4的濃度實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，而兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; IFN-γ的濃度實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第14天時(shí)，IL-4的濃度實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，而兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; IFN-γ的濃度，實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組對(duì)比，GM-CSF+α-GalCer+IL

8、-2組明顯高于α-GalCer+IL-2組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　CCK-8法檢測(cè)各組培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)不同亞型乳腺癌細(xì)胞株（MDA-MB-231、MCF-7及AU-565）的殺傷作用:兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組對(duì)三種亞型乳腺癌細(xì)胞均產(chǎn)生顯著的殺傷效果，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。GM-CSF+α-GalCer+IL-2組與α-GalCer+IL-2組相比，殺傷效果差異不顯著。而對(duì)三種乳腺癌細(xì)胞株殺傷效果之間比較，差