葉酸偶聯(lián)的載藥磁性白蛋白納米球靶向治療膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:
　　 載藥磁性白蛋白納米球的制備及表征
　　 目的:
　　 ①研究Fe3O4磁性納米粒制備及表征;②納米雄黃的制備及表征;③白蛋白納米球的制備、工藝優(yōu)化及表征;④載藥的白蛋白納米球的制備及表征;⑤磁性白蛋白納米球的制備及表征;⑥載藥磁性白蛋白納米球的制備及表征。
　　 方法:
　　 ①采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒，運(yùn)用透射電子顯微鏡（transmissionelectron

2、microscope，TEM）、X射線衍射分析(x-raydiffraction，XRD)、掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscopy，SEM）、能譜儀(energydispersivespectrometer,EDS)、磁感應(yīng)加熱試驗(yàn)對其表征，MTT(methylthiazolyltetrazolium)法檢測其生物相容性;②采用化學(xué)共沉淀法制備納米雄黃，運(yùn)用TEM、SEM、EDS、動態(tài)光衍射（dynamic

3、lightscattering，DLS）、熒光光譜測定含砷量等對其表征;③采用去溶劑化-交聯(lián)法制備普通白蛋白納米球，運(yùn)用TEM、SEM、EDS、DLS對其表征;④采用去溶劑化-交聯(lián)法制備載藥的自蛋白納米球，運(yùn)用TEM、DLS對其表征、熒光光譜儀測含砷量、計(jì)算藥物載藥量及包封率;⑤采用去溶劑化-交聯(lián)法制備磁性白蛋白納米球，運(yùn)用TEM、SEM、EDS、DLS及磁感應(yīng)加熱試驗(yàn)對其表征、硫氰酸鹽分光光度法測含F(xiàn)e量;⑥采用去溶劑化-交聯(lián)法制備載

4、藥的磁性白蛋白納米球，運(yùn)用TEM、SEM、EDS、DLS及磁感應(yīng)加熱試驗(yàn)對其表征、硫氰酸鹽分光光度法測含F(xiàn)e量、熒光光譜儀測含砷量、計(jì)算藥物載藥量及包封率。
　　 結(jié)果:
　　 ①制備的Fe3O4磁性納米粒表征:TEM、SEM檢測顯示Fe3O4磁性納米粒為圓形、電子密度高、大小較一致、分散良好;其平均粒徑約為20nm;EDS證實(shí)制備的Fe3O4磁性納米粒只含有Fe與O兩種元素;XRD顯示制備的納米粒子各衍射峰所對應(yīng)的面間

5、距（d值）與粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會(JCPDS)編制的代表物質(zhì)為尖晶石型磁性Fe3O4的PDF(PowderDiffractionFile)卡片d值吻合一致;在輸出電流20A，輸出頻率200kHz的交變磁場(alternatingmagneticfield，AMF)作用下不同濃度的Fe3O4磁性納米?；鞈乙耗苌郎氐?2℃-65℃，且加熱50min后溫度能恒定在某一水平不發(fā)生改變。材料浸提液的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的Fe3O4納米粒浸提

6、液作用L929細(xì)胞72h后，結(jié)果顯示該材料對L929細(xì)胞毒性為0-1級，均屬對細(xì)胞無毒性范疇。②自制的納米雄黃在TEM、SEM檢測下為球形，大小較一致，直徑約為50-60nm;DLS顯示納米雄黃的水合粒徑約為80nm;EDS證實(shí)制備的納米雄黃只含有As與S兩種元素;熒光光譜儀測定含砷量大約在2342.4mg/kg。③自制的白蛋白納米球在TEM、SEM檢測下為球形，大小均勻，均＜100nm，平均在80-90nm;DLS顯示白蛋白納米球的水

7、合粒徑約為110nm;EDS證實(shí)制備的白蛋白納米球只含有C、N與O三種元素。④TEM檢測顯示自制的載藥白蛋白納米球?yàn)閳A形，形態(tài)規(guī)整，大小均勻，粒徑約在120nm;DLS顯示其水合粒徑約為160nm;熒光光譜儀測定含砷量大約在46mg/kg;藥物載藥量約為2％，包封率約為72％。⑤自制的磁性白蛋白納米球在TEM、SEM檢測下為球形，大小均勻，平均在30-40nm;DLS顯示磁性白蛋白納米球的水合粒徑約為50nm;EDS證實(shí)制備的磁性白蛋白

8、納米球只含有C、N、Fe與O四種元素;在輸出電流20A，輸出頻率200kHz的AMF作用下不同濃度鐵含量的磁性白蛋白納米球能升溫到42℃-65℃，且加熱40min后溫度能恒定在某一水平不發(fā)生改變;硫氰酸鹽分光光度法測含F(xiàn)e量平均在3.5mg/ml。⑥自制的載藥磁性白蛋白納米球在TEM、SEM檢測下為球形，大小均勻，平均在140nm;DLS顯示載藥磁性白蛋白納米球的水合粒徑約為200nm;EDS證實(shí)制備的載藥磁性白蛋白納米球只含有S、As

9、、Fe與O四種元素;在輸出電流20A，輸出頻率200kHz的AMF作用下不同濃度鐵含量的載藥磁性白蛋白納米球能升溫到42℃-65℃，且加熱50min后溫度能恒定在某一水平不發(fā)生改變;硫氰酸鹽分光光度法測含F(xiàn)e量平均在3.0mg/ml;熒光光譜儀測定含砷量大約在40mg/kg;藥物載藥量為約2％，包封率約為70％。
　　 結(jié)論:
　　 成功制備了Fe3O4磁性納米粒、納米雄黃、白蛋白納米球、載藥的白蛋白納米球、磁性白蛋白納

10、米球、載藥磁性白蛋白納米球。
　　 第二部分:
　　 載藥磁性白蛋白納米球偶聯(lián)葉酸/近紅外熒光染料NIR797的制備及表征
　　 目的:
　　 ①研究載藥磁性白蛋白納米球偶聯(lián)葉酸的制備工藝及表征;②葉酸介導(dǎo)磁性白蛋白納米球表面近紅外熒光染料NIR797的制備工藝及表征。
　　 方法:
　　 ①利用葉酸活性酯與載藥磁性白蛋白納米球表面的活性氨基進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，制備葉酸偶聯(lián)載藥磁性白蛋白納米球（

11、FA-載藥磁性白蛋白納米球）;運(yùn)用TEM、SEM、DLS及磁感應(yīng)加熱試驗(yàn)對其表征、硫氰酸鹽分光光度法測含F(xiàn)e量、熒光光譜儀測含砷量、計(jì)算藥物載藥量及包封率、動態(tài)測定體外釋藥速率、紅外光譜檢測葉酸偶聯(lián)狀況;②利用NIR797上的異硫氰酸酯基，在堿性溶液中可以直接與白蛋白納米球表面的氨基反應(yīng)，制備磁性白蛋白納米球偶聯(lián)NIR797（NIR797-磁性白蛋白納米球）和葉酸介導(dǎo)磁性白蛋白納米球偶聯(lián)NIR797（FA-NIR797-磁性白蛋白納米球

12、）;運(yùn)用TEM、SEM、DLS對其表征、紫外可見近紅外分光光度計(jì)檢測近紅外熒光染料偶聯(lián)狀況。
　　 結(jié)果:
　　 ①自制的FA-載藥磁性白蛋白納米球在TEM、SEM檢測下為球形，大小均勻，平均在180nm;DLS顯示FA-載藥磁性白蛋白納米球的水合粒徑約為220nm;在輸出電流20A，輸出頻率200kHz的AMF作用下不同鐵濃度的FA-載藥磁性白蛋白納米球能升溫到42℃-65℃，且加熱50min后溫度能恒定在某一水平不發(fā)

13、生改變;硫氰酸鹽分光光度法測含F(xiàn)e量平均在2.2mg/ml;熒光光譜儀測定含砷量大約在35mg/kg;藥物載藥量為約1.6％，包封率約為62％;體外動態(tài)釋藥速率，計(jì)算其累積釋放率顯示，該材料5小時釋藥為14.56％，曲線平緩;紅外光譜檢測到葉酸有偶聯(lián)。②自制的NIR797-磁性白蛋白納米球在TEM、SEM檢測下為球形，大小均勻，平均在20-30nm;DLS顯示NIR797-磁性白蛋白納米球的水合粒徑約為50nm;紫外可見近紅外分光光度計(jì)

14、檢測偶聯(lián)上NIR797;FA-NIR797-磁性白蛋白納米球在TEM、SEM檢測下為球形，大小均勻，平均在20-40nm;DLS顯示FA-NIR797-磁性白蛋白納米球的水合粒徑約為60nm;紫外可見近紅外分光光度計(jì)檢測偶聯(lián)上NIR797。
　　 結(jié)論:
　　 成功制備了FA-載藥磁性白蛋白納米球、NIR797-磁性白蛋白納米球、FA-NIR797-磁性白蛋白納米球。
　　 第三部分:
　　 FA-NIR

15、797-磁性白蛋白納米球的體內(nèi)外靶向性評價
　　 目的:
　　 從體外細(xì)胞水平，探討FA-NIR797-磁性白蛋白納米球?qū)Υ笫竽z質(zhì)瘤細(xì)胞C6的靶向效應(yīng)，以及利用7.0TeslaMicro-MR儀對葉酸受體介導(dǎo)的靶向投遞系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測的可行性;通過動物實(shí)驗(yàn)，從在體水平探討FA-NIR797-磁性白蛋白納米球?qū)β闶蠛纱笫竽z質(zhì)瘤的靶向性、安全性，利用7.0TeslaMicro-MR儀、多光譜活體成像系統(tǒng)對其進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時監(jiān)測的可

16、行性。
　　 方法:
　　 ①體外實(shí)驗(yàn):將葉酸靶向（FA-NIR797-磁性白蛋白納米球）、非葉酸靶向（NIR797-磁性白蛋白納米球）和葉酸抑制組（FA-NIR797-磁性白蛋白納米球+葉酸）復(fù)合納米球與大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6共孵育24h后，通過普魯士藍(lán)染色、7.0TeslaMicro-MR儀檢測從體外細(xì)胞水平觀察C6細(xì)胞對葉酸受體介導(dǎo)的靶向效應(yīng)。②體內(nèi)試驗(yàn):建立裸鼠荷大鼠膠質(zhì)瘤皮下移植瘤動物模型。經(jīng)4-6周腫瘤直徑達(dá)0.

17、5cm左右始用于試驗(yàn)。對裸鼠進(jìn)行MRI、近紅外多光譜活體掃描。按分組要求，將48只裸鼠隨機(jī)分成葉酸靶向組、非葉酸靶向組和葉酸抑制組，每組16只，葉酸靶向組經(jīng)尾靜脈注射FA-NIR797-磁性白蛋白納米球，非葉酸靶向組經(jīng)尾靜脈注射NIR797-磁性白蛋白納米球，葉酸抑制組經(jīng)尾靜脈注射FA-NIR797-磁性白蛋白納米球和葉酸，注射劑量均為5mgFe/kg。注射前及注射后不同時點(diǎn)(1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h)分別進(jìn)行MR

18、I成像，測量感興趣區(qū)（腫瘤、肌肉組織）T2WI及T2*WI信號強(qiáng)度，計(jì)算信號變化率，最后用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析;分別進(jìn)行近紅外多光譜活體成像，實(shí)時在位監(jiān)測葉酸靶向、非葉酸靶向和葉酸抑制組復(fù)合納米球在荷瘤鼠體內(nèi)的動態(tài)過程。NIR序列激發(fā)（670nm-900nm或740nm-950nm，間隔10nm）。特異性信號應(yīng)用MaestroTMEX2.10軟件進(jìn)行光譜分離。病理組織學(xué)檢查:包括常規(guī)HE染色、普魯士藍(lán)染色。
　　

19、 結(jié)果:
　　 ①體外實(shí)驗(yàn):普魯士藍(lán)染色顯示葉酸靶向組與C6細(xì)胞共孵育后，細(xì)胞內(nèi)大量鐵存在;而非靶向組和葉酸抑制組細(xì)胞內(nèi)少見明顯鐵顆粒的存在。體外MRI成像顯示葉酸靶向組與C6細(xì)胞共孵育后在T2WI上信號強(qiáng)度不同程度的降低，而菲靶向組與葉酸抑制組與C6細(xì)胞共孵育后在T2WI上信號強(qiáng)度無明顯降低。②體內(nèi)試驗(yàn):在體MRI成像結(jié)果顯示，注射葉酸靶向組后腫瘤組織不同時間點(diǎn)的T2WI、T2*WI強(qiáng)度及信號變化率均有明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

20、異。而菲靶向組和葉酸抑制組在注射后1h和2h兩個時間點(diǎn)的信號亦有輕度下降，但下降幅度較葉酸靶向組小，且持續(xù)時間較靶向組短（非靶向組注射后24h的信號強(qiáng)度即恢復(fù)至平掃水平，而靶向組注射后24h的信號強(qiáng)度仍然維持在較低水平，且隨著時間的延長，信號越來越低）。在體近紅外多光譜活體成像結(jié)果顯示，葉酸靶向組在注射FA-NIR797-磁性白蛋白納米球1h后，它的的熒光信號主要集中在肝臟部位。在注射24h后，熒光信號開始出現(xiàn)在腫瘤的部位。隨著時間的延

21、長，腫瘤的熒光信號變得更強(qiáng)，肝的部位熒光信號開始減弱。在注射72h后，腫瘤位置的信號達(dá)至最強(qiáng)。非靶向組和葉酸抑制組在分別注射NIR797-磁性白蛋白納米球和FA-NIR797-磁性白蛋白納米球+葉酸1h后，它們的熒光信號主要集中在肝臟部位。在注射24h后，熒光信號仍然在肝臟。隨著時間的延長，腫瘤未見有熒光信號。病理學(xué)檢查:普魯士藍(lán)染色顯示葉酸靶向組腫瘤組織內(nèi)有較多藍(lán)染的鐵顆粒，而非靶向組和葉酸抑制組則幾乎未見鐵顆粒的存在。
　　

22、 結(jié)論:
　　 體外細(xì)胞水平FA-NIR797-磁性白蛋白納米球?qū)Υ笫竽z質(zhì)瘤細(xì)胞C6具有較好的靶向效應(yīng)。在體水平FA-NIR797-磁性白蛋白納米球?qū)β闶蠛纱笫竽z質(zhì)瘤移植瘤具有良好的靶向性。
　　 第四部分:
　　 FA-載藥磁性白蛋白納米球治療膠質(zhì)瘤的體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 從體外細(xì)胞水平，探討FA-載藥磁性白蛋白納米球熱化療對大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的抑制效應(yīng);通過動物實(shí)驗(yàn)，從在體水

23、平探討FA-載藥磁性白蛋白納米球熱化療對裸鼠荷C6移植瘤的治療作用。
　　 方法:
　　 將單純培養(yǎng)液空白對照組、FA-載藥磁性白蛋白納米球聯(lián)合AMF熱療組、FA-載藥磁性白蛋白納米球非聯(lián)合AMF熱療組、載藥磁性白蛋白納米球聯(lián)合AMF熱療組、載藥磁性白蛋白納米球非聯(lián)合AMF熱療組、載藥白蛋白納米球組、磁性白蛋白納米球組作用于C6細(xì)胞株，MTT法研究處理后細(xì)胞的增殖抑制作用，流式細(xì)胞儀(flowcytometry,FCM)

24、測定處理后細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞法制作裸鼠膠質(zhì)瘤模型，實(shí)驗(yàn)分為7組:第1組為空白對照組，第2組為FA-載藥磁性白蛋白納米球聯(lián)合AMF熱療組、第3組為FA-載藥磁性白蛋白納米球非聯(lián)合AMF熱療組、第4組為載藥磁性白蛋白納米球聯(lián)合AMF熱療組、第5組為載藥磁性白蛋白納米球非聯(lián)合AMF熱療組、第6組為載藥白蛋白納米球組、第7組為磁性白蛋白納米球組。實(shí)驗(yàn)動物在治療后進(jìn)行MR掃描，觀察腫瘤的生長情況，測量腫瘤的直徑（長徑和短徑），計(jì)算治療前后每組動物

25、腫瘤的體積變化并計(jì)算體積抑制率，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測腫瘤質(zhì)量抑制率。
　　 結(jié)果:
　　 FA-載藥磁性白蛋白納米球聯(lián)合AMF熱療作用于大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株后對其生長具有強(qiáng)烈的抑制作用并具有誘導(dǎo)其凋亡的作用，MTT結(jié)果顯示該組細(xì)胞的生長抑制率(68.27％)明顯高于FA-載藥磁性白蛋白納米球非聯(lián)合AMF熱療組(50.57％)、載藥磁性白蛋白納米球聯(lián)合AMF熱療組(44.60％)、磁性白蛋白納米球組(36.49％)、載藥磁性白蛋白納米

26、球非聯(lián)合AMF熱療組(25.64％)、載藥白蛋白納米微球組(24.32％)，而空白對照組則對細(xì)胞生長無抑制作用。流式結(jié)果也顯示該組的凋亡率(46.33％)明顯高于FA-載藥磁性白蛋白納米球非聯(lián)合AMF熱療組(36.72％)、載藥磁性白蛋白納米球聯(lián)合AMF熱療組(34.28％)、磁性白蛋白納米球熱療組(29.15％)、載藥磁性白蛋白納米球非聯(lián)合AMF熱療組(17.68％)、載藥白蛋白納米球組(17.12％)，而空白對照組則無凋亡作用。在體