深Ⅱ度燒傷皮膚細(xì)胞外基質(zhì)降解產(chǎn)物的自噬誘導(dǎo)活性及其可再生利用的初步研究.pdf

1、背景：深度燒傷創(chuàng)面的治療，特別是對(duì)于功能部位的治療，一直是燒傷外科領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。臨床顯示，大面積深度燒傷患者自體皮源缺乏而導(dǎo)致創(chuàng)面閉合困難，而應(yīng)用無(wú)細(xì)胞真皮替代物與自體刃厚皮或培養(yǎng)表皮片復(fù)合移植治療大面積深度燒傷創(chuàng)面不僅解決了創(chuàng)面封閉困難問(wèn)題，而且還能夠明顯減輕超薄皮片瘢痕增生和攣縮畸形的產(chǎn)生。然而異源性支架材料存在免疫原性且價(jià)格昂貴，難以滿足燒傷患者大面積植皮的需要。近年研究顯示，保留燒傷變性真皮，同時(shí)移植自體刃厚或薄中厚皮片

2、治療深度燒傷創(chuàng)面，術(shù)后移植區(qū)功能及外形恢復(fù)良好，提示燒傷變性皮膚能可逆性恢復(fù)部分真皮功能和形態(tài)的特點(diǎn)。大面積深Ⅱ度燒傷患者切痂術(shù)后丟棄的變性真皮是否可再利用成為本課題研究的重點(diǎn)。
　　近年，自噬是生命科學(xué)最熱的研究領(lǐng)域，自噬是真核細(xì)胞特有的普遍生命現(xiàn)象，在維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞生存方面起重要作用，廣泛參與多種生理和病理過(guò)程。研究顯示，溶酶體酶可轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)內(nèi)側(cè)甚至分泌到細(xì)胞外降解ECM，同時(shí)細(xì)胞發(fā)生自噬的機(jī)制也與溶酶體酶大量釋放

3、有關(guān)[1]，推測(cè)ECM降解產(chǎn)物與細(xì)胞自噬存在某種關(guān)聯(lián)，具有細(xì)胞自噬誘導(dǎo)活性。
　　因此，本研究旨在探討深Ⅱ度燒傷皮膚(DBS)中的ECM降解產(chǎn)物是否具有自噬誘導(dǎo)活性、深Ⅱ度燒傷真皮基質(zhì)(DBDM)的制備方法、組織相容性以及作為真皮替代物修復(fù)深度燒傷創(chuàng)面的可行性。
　　目的：(1)觀察自噬相關(guān)基因Beclin1在大鼠深Ⅱ度燒傷皮膚(DBS)中的表達(dá)，初步探討自噬與燒傷皮膚之間的關(guān)系。(2)探討DBDM是否具有自噬誘導(dǎo)活性;并探

4、討利用DBS作為真皮替代物構(gòu)建復(fù)合皮移植模型進(jìn)行修復(fù)創(chuàng)面的可行性。
　　方法：(1)16只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組（對(duì)照組）和燙傷組（實(shí)驗(yàn)組），每組各8只。實(shí)驗(yàn)組建立DBS模型，燙傷后分別于1、3、7d取材。組織學(xué)檢查觀察各組動(dòng)物皮膚全層情況，免疫組化檢測(cè)Beclin1在各組動(dòng)物皮膚的表達(dá)，并行圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(2)真皮支架制作:采用酶消化法[2]，實(shí)驗(yàn)組取2只大鼠燙傷24h后皮膚進(jìn)行脫細(xì)胞等處理，制備DBDM;對(duì)

5、照組采用Wistar大鼠正常皮膚制備ADM。①埋植實(shí)驗(yàn):20只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為深Ⅱ度燒傷真皮基質(zhì)(DBDM)埋植組（實(shí)驗(yàn)組）和無(wú)細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)埋植組（對(duì)照組），每組10只。各組分別于3d、1w、2w、3w時(shí)取材，組織學(xué)檢查觀察真皮支架內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，免疫組化檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)Beclin1在真皮支架的表達(dá)水平，并行圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。②復(fù)合皮移植實(shí)驗(yàn):20只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為深Ⅱ度燒傷真皮基質(zhì)(DBDM)移

6、植組（實(shí)驗(yàn)組）和無(wú)細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)移植組（對(duì)照組），每組10只。取新生24h內(nèi)大鼠乳鼠背部完整皮膚，修薄后與網(wǎng)狀DBDM（實(shí)驗(yàn)組）一次性重疊移植到大鼠背部約2cm×2cm全層皮膚缺損創(chuàng)面，14d后觀察復(fù)合皮生長(zhǎng)情況。對(duì)照組ADM與薄的大鼠乳鼠表皮片重疊進(jìn)行復(fù)合移植，實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)驗(yàn)組。
　　結(jié)果：(1)Beclin1蛋白在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)陽(yáng)性，對(duì)照組表達(dá)陰性，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(2)新鮮制備的DBDM呈淺黃白

7、色，質(zhì)地較柔軟，有一定的韌性和伸展性，較ADM弱。鏡下膠原纖維增粗和透明樣變，排列紊亂、疏松，無(wú)細(xì)胞、血管和毛囊等成分存在。①埋植實(shí)驗(yàn):術(shù)后各組大鼠創(chuàng)口周?chē)つw無(wú)明顯腫脹及炎性反應(yīng)，切口愈合良好，移植物與創(chuàng)面組織愈著緊密。組織學(xué)觀察，DBDM及ADM植入3d時(shí)，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等浸潤(rùn)。植入1w時(shí)，各支架內(nèi)可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞侵入、增生，并沿膠原纖維方向分布，新生毛細(xì)血管向移植物內(nèi)部延伸。植入2w、3w時(shí)，移植物內(nèi)血管數(shù)

8、量進(jìn)一步增多，并在移植物內(nèi)廣泛分布。免疫組織化學(xué)染色顯示，實(shí)驗(yàn)組Beclin1蛋白的表達(dá)量于1w時(shí)達(dá)到高峰，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。②復(fù)合皮移植實(shí)驗(yàn):術(shù)后14d，兩組大鼠及移植物的成活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，雙層復(fù)合皮與皮下組織緊密連接，深層DBDM或ADM呈粉紅色，未見(jiàn)明顯腫脹及炎性反應(yīng)。與ADM相比，DBDM組移植物較早出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管長(zhǎng)入;炎性細(xì)胞以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主

9、，新生膠原蛋白沉積較快，纖維排列規(guī)則、致密。
　　結(jié)論：(1)Beclin1蛋白在Wistar大鼠燙傷皮膚中的表達(dá)呈陽(yáng)性，推測(cè)自噬參與深Ⅱ度燙傷皮膚的修復(fù)過(guò)程。(2)DBDM來(lái)源廣泛、制備方法簡(jiǎn)單，移植物生物相容性好，無(wú)皮膚燒傷毒素樣反應(yīng)，具有增強(qiáng)自噬誘導(dǎo)活性，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬清除受損細(xì)胞器，使細(xì)胞免于受到進(jìn)一步損傷及發(fā)生凋亡，為轉(zhuǎn)入修復(fù)階段創(chuàng)造條件，具有恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)的潛力，可充當(dāng)自體刃厚皮片的真皮替代物。本研究可為今后臨床改造和利用