不同尺度二氧化鈦納米顆粒的細(xì)胞毒性及其機(jī)制研究.pdf

1、鈦及鈦合金因具有良好的力學(xué)性能和生物相容性，被廣泛地應(yīng)用為臨床骨植入體。但是，由于其固有的表面惰性，鈦基植入體只能通過機(jī)械鎖合方式與周圍骨組織整合。因此，在過去幾十年中，科研工作者通過調(diào)控適宜的鈦基材表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以期獲得高性能鈦基植入體。近年來，伴隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，利用納米表面工程化鈦基表面(納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu))調(diào)控細(xì)胞行為的研究備受關(guān)注。
　　然而，在長(zhǎng)期臨床應(yīng)用（例如，鈦髖關(guān)節(jié)植入體）中，由于腐蝕、無菌性松動(dòng)和假體摩擦，植入體

2、/骨界面不可避免地會(huì)產(chǎn)生微米級(jí)或納米級(jí)的磨損顆粒。本論文利用水熱法合成了不同尺度的二氧化鈦納米顆粒，模擬鈦合金植入體的納米級(jí)的磨損顆粒，進(jìn)而研究磨損顆粒對(duì)成骨細(xì)胞、骨髓骨間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為研發(fā)新型鈦基植入體積累知識(shí)。本文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：
　　1．不同尺度二氧化鈦納米顆粒的合成
　　利用水熱法合成了不同尺度的二氧化鈦納米顆粒。分別利用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對(duì)一系列二氧化鈦納米顆粒的形貌進(jìn)行了表征。結(jié)果

3、顯示，二氧化鈦納米顆粒具有均一的形態(tài)特征和較好的分散性。顆粒粒徑分布分別為:14±3 nm、39±8 nm、74±15 nm、108±23 nm、136±34 nm及196±50 nm。X射線衍射儀表征證實(shí)：二氧化鈦納米顆粒呈高結(jié)晶度，晶相結(jié)構(gòu)符合銳鈦礦相(PDF21-1272)。
　　2．200納米以下不同尺度二氧化鈦顆粒的細(xì)胞毒性與其尺度的相關(guān)性
　　為了評(píng)價(jià)鈦基全關(guān)節(jié)植入體產(chǎn)生的納米尺度磨損顆粒對(duì)細(xì)胞的影響，在本文中，

4、我們首先研究了不同尺度的二氧化鈦納米顆粒對(duì)成骨細(xì)胞生物功能的影響。細(xì)胞活力和堿性磷酸酶活性評(píng)價(jià)表明：納米顆粒的負(fù)效應(yīng)隨顆粒尺度的增加而增大(p<0.05，p<0.01)。利用透射電子顯微鏡、溶酶體染色和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)了納米顆粒對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響以及在細(xì)胞中的分布。結(jié)果表明：二氧化鈦納米顆粒僅存留于細(xì)胞質(zhì)中，而未進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞核中。利用吞噬抑制劑，我們進(jìn)一步研究了不同納米顆粒內(nèi)吞機(jī)制。結(jié)果證實(shí)：不同尺度的納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)吞作用的途

5、徑不同。最后，我們研究了不同納米顆粒對(duì)成骨細(xì)胞核受體激活核因子κB配體（RANKL）的表達(dá)、基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP-9活性以及細(xì)胞凋亡的影響。研究證實(shí)：隨著顆粒粒徑的增加，負(fù)效應(yīng)也隨之顯著增加。總之，所有數(shù)據(jù)表明，銳鈦礦型TiO2納米顆粒對(duì)成骨細(xì)胞的負(fù)效應(yīng)隨顆粒尺度的增加而增大，為納米鈦基植入體的安全性評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。
　　3.不同尺度二氧化鈦納米顆粒對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附、增殖、遷移和分化的影響
　　為進(jìn)一步研究鈦基人工關(guān)

6、節(jié)植入體的納米尺度磨損顆粒對(duì)骨整合性的影響，我們從細(xì)胞水平到分子水平研究了不同TiO2納米顆粒（模型）對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的粘附、遷移、增殖和分化的影響。MSCs的活力、增殖以及細(xì)胞周期呈現(xiàn)與TiO2納米顆粒的尺度和使用的劑量相關(guān)(p<0.01)。利用激光共聚焦顯微鏡考察了細(xì)胞內(nèi)吞的納米顆粒對(duì)MSCs的粘附、鋪展及細(xì)胞形態(tài)的影響。研究結(jié)果證實(shí)，大尺度的TiO2顆粒嚴(yán)重破壞了MSCs的細(xì)胞膜的完整性、細(xì)胞骨架的鋪展和粘著斑蛋白。

7、Transwell分析和傷口愈合實(shí)驗(yàn)證明：隨著TiO2納米顆粒尺度的增加，對(duì)細(xì)胞遷移的不利影響越嚴(yán)重。此外，堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白的基因表達(dá)以及礦化測(cè)試表明，大尺度的TiO2納米顆粒對(duì)MSCs的成骨細(xì)胞分化具有顯著的負(fù)面影響。本研究積累的知識(shí)可為設(shè)計(jì)新型納米結(jié)構(gòu)的鈦金屬植入體提供思路。
　　4.不同納米顆粒的表面特征及化學(xué)性質(zhì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響
　　本文中，我們合成了尺度為100 nm左右的三種納米顆粒（介孔 SiO

8、2、Fe3O4以及 TiO2顆粒）。納米顆粒的形貌、晶相以及表面電荷分別用掃描電子顯微鏡、X射線衍射儀及Zeta電位儀表征。進(jìn)而，我們研究了不同納米顆粒的形貌和表面電荷對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。研究表明：當(dāng)納米顆粒的濃度小于0.20 mg/mL時(shí)，介孔SiO2和Fe3O4納米顆粒的劑量依賴毒性不明顯；但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的負(fù)效應(yīng)顯著增加。在高劑量(>0.20 mg/mL)情況下，不同納米顆粒對(duì)細(xì)胞的毒性表現(xiàn)出劑量和時(shí)間相關(guān)性。進(jìn)一步