復(fù)方中藥對山羊瘤胃發(fā)酵及細菌菌群的影響研究.pdf

1、中草藥具有營養(yǎng)和藥用雙重作用，且藥物殘留低，因此研究中草藥對反芻動物日糧營養(yǎng)的調(diào)控具有重要的理論和實際意義。本課題自擬復(fù)方中藥“壯牛靈1、2、3”、“育肥散1、2、3”以及抗熱應(yīng)激復(fù)方，以瘤胃素為參照，以空白為對照，選擇36頭安裝有永久性瘤胃瘺管山羊，采用隨機單位平均分組設(shè)計，結(jié)合傳統(tǒng)手段和分子生物學(xué)方法研究其對山羊瘤胃發(fā)酵和細菌菌群的影響，探討復(fù)方中藥對山羊瘤胃發(fā)酵特性的調(diào)控作用。
　　一、復(fù)方中藥對山羊瘤胃發(fā)酵的影響
　

2、　采集第20-22日飼喂前0h和飼喂后2h、4h、6h、8h、10h、12h共計7個時間點的瘤胃液，研究復(fù)方中藥對山羊瘤胃pH、氨氮(NH3-N)濃度、微生物蛋白(MCP)含量以及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同復(fù)方中藥對瘤胃液pH值的影響范圍為6.22～6.91，各組影響差異不顯著(P＞0.05)，但不同復(fù)方中藥組pH均值明顯升高;7種復(fù)方中藥對NH3-N濃度的影響差異不顯著(P＜0.05)，“育肥散2”組瘤胃內(nèi)MCP

3、含量顯著升高(P＜0.05)，“壯牛靈1”組MCP含量顯著最低(P＜0.05);“育肥散2”組總揮發(fā)性脂肪酸顯著高于瘤胃素組(P＜0.05)，其他處理組TVFA含量降低，差異不顯著(P＞0.05);“育肥散2”組乙酸顯著高于瘤胃素(P＜0.05);除“育肥散2”組外，瘤胃素組丙酸顯著高于其他各組(P＜0.05)，“育肥散2”組丙酸含量升高;“育肥散2”、抗熱應(yīng)激與“壯牛靈3”組丁酸含量顯著升高(P＜0.05)，瘤胃素組丁酸含量顯著低于其

4、他各組(P＜0.05);瘤胃素組乙丙比顯著降低(P＜0.05)，“育肥散1”和抗熱應(yīng)激組顯著升高(P＜0.05)。結(jié)論:所有復(fù)方中藥均能延緩山羊瘤胃內(nèi)pH下降，復(fù)方中藥“育肥散2”顯著增加瘤胃內(nèi)MCP含量，乙酸和丁酸產(chǎn)量增加;其他復(fù)方中藥處理組瘤胃乙酸產(chǎn)量降低，從而使降低VFA濃度，其中“壯牛靈1”和“壯牛靈2”效果較優(yōu)。
　　二、復(fù)方中藥對山羊瘤胃細菌菌群的影響
　　提取第20、21、22日晨飼前0h瘤胃液細菌DNA，每頭

5、羊不同采集時間的DNA等量混合，利用細菌16S rDNA V4區(qū)序列為引物進行PCR擴增，采用IlluminaMiseq PE300測序，進行物種注釋及豐度分析，進一步α和β多樣性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):36個樣品共得到1，445，331條tags，大約有81％的原始reads通過了所有質(zhì)量控制，OTU分析顯示樣品Total tags中能夠被注釋到物種的Taxon Tags豐富，各樣品中相似性沒有到達97％的OTUs序列大于最終獲得的OTUs數(shù)

6、目。物種注釋顯示在不同的分類水平下，除“壯牛靈2”以外，瘤胃素組所獲得的OTUs豐度顯著多于其他組(P＜0.05)，“壯牛靈3”分類在各級別的OTUs豐度顯著降低(P＜0.05)。樣品復(fù)雜度分析發(fā)現(xiàn)，空白組與“育肥散1”、“育肥散2”組的樣品物種OTU飽和曲線、Chao1曲線和香農(nóng)指數(shù)較高，其秩多度曲線豐富度和均勻度較高，而瘤胃素、“壯牛靈1”、“壯牛靈3”以及“育肥散3”組樣品物種OTU飽和曲線、Chao1曲線和香農(nóng)指數(shù)低，秩多度曲線

7、其豐富度和均勻度較低?；陂T分類水平上，將所有的序列鑒定為11個門，其中擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和硬壁菌門(Firmicutes)為所有樣品優(yōu)勢菌門，“壯牛靈1”、“壯牛靈3”、抗熱應(yīng)激以及瘤胃素組中硬壁菌門相對豐度顯著降低（P＜0.05），此外，瘤胃素組中變形菌門相對豐度顯著升高（P＜0.05）。根據(jù)相對豐度排在前10的屬進行物種注釋，普雷沃氏菌屬（Prevotella）為各樣品

8、中優(yōu)勢菌屬，琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）在抗熱應(yīng)激和瘤胃素組中比例較高，待定屬TG5在“壯牛靈1”中比例較高。PCoA分析發(fā)現(xiàn)納入本研究的36個山羊瘤胃菌群呈現(xiàn)連續(xù)分布的特點，同一處理“壯牛靈1”、“壯牛靈2”、“育肥散3”、抗熱應(yīng)激、瘤胃素組樣品有聚類趨勢，“壯牛靈1”與“壯牛靈2”樣品有明顯交疊現(xiàn)象。結(jié)論:除“育肥散1”、“育肥散2”外，其他復(fù)方中藥瘤胃菌群群落多樣性顯著降低，其中“壯牛靈3”瘤胃菌群群落豐度顯著降低，

9、所有樣品中變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、硬壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢菌門，“壯牛靈1”、“壯牛靈3”、抗熱應(yīng)激對瘤胃菌群中硬壁菌門的相對豐度顯著降低，普雷沃氏菌屬(Prevotella)為36例樣品瘤胃菌群中的優(yōu)勢菌屬。
　　三、復(fù)方中藥山羊瘤胃纖維降解菌數(shù)量的影響
　　提取第20，21和22日早晨飼喂前(0h)瘤胃液細菌DNA，應(yīng)用Real-timePCR對產(chǎn)琥

10、珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌進行絕對定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):“壯牛靈1”與“育肥散2”組對白色瘤胃球菌數(shù)量的影響不顯著（P＞0.05），其他復(fù)方中藥組在白色瘤胃球菌的數(shù)量顯著降低(P＜0.05);除瘤胃素組外，“育肥散2”組中黃色瘤胃球菌數(shù)量顯著高于其他各組(P＜0.05);瘤胃素組中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量顯著升高（P＜0.05），復(fù)方中藥組差異不顯著(P＞0.05)。
　　結(jié)論:“壯牛靈1”和“育肥散2”對白色瘤胃球菌數(shù)量無顯