膿毒癥調(diào)節(jié)性T細胞功能變化規(guī)律及發(fā)生機制的初步探討.pdf

1、目的:
　　調(diào)節(jié)性T細胞(regulatoryTcells，Treg)是一類具有調(diào)節(jié)功能的成熟的T細胞亞群，對免疫耐受和免疫平衡的維持發(fā)揮著重要作用，在膿毒癥感染免疫中的作用也受到了越來越多的關(guān)注。Treg表現(xiàn)為免疫無能性和免疫抑制性兩大特性，主要通過細胞接觸機制和細胞因子分泌方式發(fā)揮作用。目前嚴重膿毒癥(seversepsis)患者臨床死亡率高達50％，膿毒癥發(fā)病機制中超過半數(shù)為革蘭陰性菌所致。在對革蘭陰性菌及其產(chǎn)物的識別中，T

2、oll樣受體4(Toll-likereceptor4，TLR4)起著關(guān)鍵作用，同時也是聯(lián)系固有免疫和獲得性免疫的橋梁。鑒于TLR4在脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)信號轉(zhuǎn)導的重要性，而且其本身也為Treg細胞表面的膜分子，那么在膿毒癥發(fā)病過程中，TLR4是否通過作用于Treg影響了免疫功能紊亂的發(fā)生發(fā)展呢?本實驗通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(Cecelliagtionpuncture，CLP)建立膿毒癥模型，采用免疫磁珠分

3、離法(magneticcellsorting，MACS)分離小鼠脾臟的Treg，通過檢測膿毒癥中Treg細胞的功能變化和凋亡情況，以及TLR4表達的變化規(guī)律，分析膿毒癥Treg功能變化規(guī)律，并初步探討TLR4與Treg功能變化間的可能聯(lián)系。
　　方法:
　　(1)模型制備：SPF級C57BL/6小鼠隨即分為模型(CLP)組及假手術(shù)(Sham)組，各20只，模型組行CLP建立膿毒癥小鼠模型，檢測術(shù)后24h、48h、72h存活率

4、情況，并于術(shù)后24h檢測正常(Normal)組、Sham組和CLP組外周血中細胞因子水平變化情況。
　　(2)采用免疫磁珠法分離獲取小鼠脾臟CD4+CD25-T細胞及CD4+CD25+Treg細胞，并鑒定細胞純度。
　　(3)分離小鼠CD4+CD25+Treg及CD4+CD25-T細胞，設(shè)單純效應T細胞(effectorTcellTeff)對照組，另依CD4+CD25+Treg：Teff胞比例1:1，分別設(shè)置Teff細胞與S

5、ham組、CLP24h組和CLP48h組的Treg共培養(yǎng)，加入抗CD-3、抗CD-28共刺激72h，通過噻唑藍(thiazolylblue，MTT)比色分析法分析Treg對Teff增殖的抑制狀況。
　　(4)Treg與CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)68h后，分別留取細胞上清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunoabsorbentassay，ELISA)法測定細胞因子的分泌情況。
　　(5)免疫磁珠法分離C

6、D4+CD25+Treg，用Annexin-V-FITC及Propidiumiodide(PI)標記Treg，流式細胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測Treg的凋亡情況。
　　(6)提取三組Treg的mRNA，SYBRGREEN法檢測TLR4及Treg的特異性標志物叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor，F(xiàn)oxp3)mRNA表達情況。
　　(7)分離S

7、ham組、CLP24h組和CLP48h組小鼠Treg，分別Anti-MouseCD152、Anti-mouseFoxp3FITC和Anti-mouseTLR4(CD284)抗體標記T淋巴細胞毒性相關(guān)抗原4(cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4，CTLA-4)、Foxp3以及TLR4，流式細胞儀檢測表達情況。
　　結(jié)果:
　　(1)術(shù)后CLP組小鼠出現(xiàn)一系列符合膿毒癥癥狀的表現(xiàn)，死亡均

8、發(fā)生在術(shù)后12小時之后，72h死亡率50％，初步建立了穩(wěn)定的膿毒癥小鼠模型；造模后24h呈現(xiàn)出免疫功能的紊亂。
　　(2)經(jīng)過多次細胞分選實驗證實，正常小鼠脾細胞經(jīng)過MACS兩次分選后，Treg細胞純度可達到92.13％～98.62％，CD4+CD25-T細胞純度可達88.70％～95.33％，所獲得的Treg細胞經(jīng)臺盼藍檢測活性大于96％。
　　(3)CD4+CD25-T細胞活化后表現(xiàn)出增殖反應，與Treg共培養(yǎng)后CD4+

9、CD25-T細胞增殖反應受到抑制，Sham組、CLP24h組和CLP48h組CD4+CD25-T細胞的增殖抑制率分別為37.55％、53.91％、62.40％。
　　(4)與Normal組比較，Sham組、CLP24h組和CLP48h組共培養(yǎng)上清中促炎因子IL-2、IFN-γ明顯下降，抗炎因子IL-4、IL-10含量明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中以CLP24h組和CLP48h組變化更為明顯(P<0.01)，表

10、明膿毒癥Treg促使Teff發(fā)生由Th1向Th2的漂移。
　　(5)與Sham組相比，CLP后Treg的凋亡明顯減少，其中CLP48h組與Sham組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　(6)與Sham組相比，CLP24h和48h組Foxp3mRNA表達均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，以CLP48h組上升為著(P<0.01)。與Sham組比較，CLP24h和48h組Foxp3的蛋白表達亦明顯升高(P<0.05

11、或P<0.01)，且CLP48h組上調(diào)為著(P<0.01)；同時，CLP24h和48h組CTLA-4在Treg的蛋白表達也明顯高于Sham組(P<0.05)。
　　(7)與Sham組相比，CLP24h和48h組TLR4mRNA均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，以CLP48h組上升為著(P<0.01)。與Sham組比較，CLP24h和48h組TLR4蛋白的表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且CLP48h組上調(diào)為著(

12、P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　(1)應用盲腸結(jié)扎穿孔法建立的膿毒癥動物模型，穩(wěn)定、可靠，適合后續(xù)的實驗研究。
　　(2)采用兩步法免疫磁珠分離Treg細胞，所得細胞純度高，細胞活力無影響，完全可以滿足進一步實驗的要求。
　　(3)膿毒癥時Treg的功能與活性明顯增強，鑒于其免疫負向調(diào)節(jié)作用，提示Treg在膿毒癥免疫功能紊亂的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用：
　?、賂reg對Teff增殖抑制作用明顯增強；
　

13、?、赥reg通過抑制促炎細胞因子IL-2、IFN-γ等分泌，促進抗炎細胞因子IL-4、IL-10等分泌，促使Th1/Th2平衡發(fā)生Th2偏移；
　　③膿毒癥Treg的凋亡明顯下降，以凋亡方式清除的Treg數(shù)量減少，提示發(fā)揮功能活性的Treg的數(shù)量增加；
　?、苡绊懞蜎Q定Treg發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，以及Treg發(fā)揮接觸抑制效應的重要膜分子CTLA-4的表達均明顯增加；
　　(4)Treg中TLR4的表達變