EphA4受體及其下游信號蛋白與K562細(xì)胞侵襲力相關(guān)性研究.pdf

1、[研究背景和目的]
　　 慢性髓系白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)是起源于多能造血干細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病，其分子生物學(xué)基礎(chǔ)為染色體畸變與異常融合基因的形成。以白血病細(xì)胞異常增生及浸潤為主要特征。臨床表現(xiàn)為脾臟腫大、外周血白細(xì)胞極度升高并出現(xiàn)幼稚粒細(xì)胞，嗜堿、嗜酸粒細(xì)胞增多，常有貧血、血小板增多。CML分為慢性期(chronicphase，CP)、加速期(acceleratephase，AP)、急

2、變期(blastcrisis，BCA)，急變期可有骨髓外原始細(xì)胞浸潤，如皮膚或臟器浸潤，甚至出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病。
　　 近年來，國內(nèi)外學(xué)者對白血病的研究在基礎(chǔ)與臨床方面均取得了重大進(jìn)展，新型的分子靶向藥物及改良化療方案的推出使白血病的治療取得了巨大進(jìn)步，異基因造血干細(xì)胞移植也極大提高了白血病患者的生存率。但是，白血病的髓外浸潤依然是臨床上亟待解決的問題，初診時(shí)伴髓外浸潤的病人往往化療效果欠佳且易復(fù)發(fā)，髓外白血病亦常常成為造血

3、干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)的根源;而目前尚無常規(guī)手段對白血病髓外浸潤進(jìn)行全面監(jiān)測。因此對白血病髓外浸潤的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)研究、探索相關(guān)的分子及信號通路異常、尋找可以利用的靶點(diǎn)，對髓外白血病的早期診斷和治療具有實(shí)際意義。
　　 白血病髓外浸潤與細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)密切相關(guān)。侵襲性是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，侵襲性高的腫瘤細(xì)胞在分泌各種溶解酶破壞細(xì)胞外基質(zhì)的同時(shí)，還可通過增強(qiáng)的遷移能力使其更容易向周圍組織浸潤。如前所述，CML在進(jìn)展到急變期后易發(fā)生

4、髓外浸潤，這與CML細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng)是分不開的。
　　 細(xì)胞表面受體與配體的結(jié)合可調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，這個(gè)過程包括細(xì)胞表面受體與鄰近細(xì)胞表面配體結(jié)合、受體配體結(jié)合激活調(diào)控信號進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、調(diào)控信號重塑細(xì)胞骨架使細(xì)胞發(fā)生定向伸展運(yùn)動(dòng)。研究表明，Eph受體家族整合信號是調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移與侵襲的關(guān)鍵點(diǎn)，Eph受體家族有望成為監(jiān)測及治療白血病髓外浸潤的突破口。促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞(erythropoietin-producinghumanhep

5、atocellular，Eph)受體家族為酪氨酸激酶受體家族(receptortyrosinekinases，RTKs)中最大的亞群，目前共有25個(gè)成員，包括16個(gè)Eph受體:EphA(EphA1-EphA10)、EphB（EphB1-EphB6）與9個(gè)ephrin配體:ephrinA(ephrinA1-ephrinA6)、ephrinB(ephrinB1-ephrinB3)。由于此家族中的每個(gè)成員均具有扮演配體或受體角色的能力，因此E

6、ph/ephrin能夠結(jié)合雙向信號，當(dāng)不同細(xì)胞表面的Eph受體與ephrin配體結(jié)合后可同時(shí)發(fā)生酪氨酸磷酸化，從而介導(dǎo)雙向信號傳遞，激活多重下游信號通路，主要包括Ras/Raf/MAPK與PI-3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，且這些信號通路中多有交叉。其中，在眾多的下游信號蛋白中，小G蛋白RhoGTP酶的激活可致細(xì)胞骨架重塑而改變細(xì)胞粘附、極性及運(yùn)動(dòng)方向，是細(xì)胞間CIL作用的重要調(diào)控者。目前關(guān)于EphA4在CML髓外浸潤方面的研究尚未見報(bào)道。

7、
　　 EphA4受體的構(gòu)象具有多樣性，是唯一能夠與所有九個(gè)ephrin配體相結(jié)合的受體。EphA4所具有的這種可以和多種ephrin配體結(jié)合的特性，使得EphA4能夠廣泛參與生物功能的執(zhí)行和調(diào)節(jié)。大量研究表明，EphA4作為重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，被相應(yīng)配體激活后，能夠調(diào)整細(xì)胞形態(tài)，在細(xì)胞遷移、細(xì)胞-細(xì)胞作用、細(xì)胞-基質(zhì)作用、細(xì)胞凋亡和增殖中起重要作用。在腫瘤研究方面，EphA4的表達(dá)與胃癌的轉(zhuǎn)移、分期具有相關(guān)性;在神經(jīng)研究方

8、面，EphA4的上調(diào)會通過對細(xì)胞骨架、形態(tài)的調(diào)節(jié)促進(jìn)樹突棘的回縮而降低其密度。AstinJW等發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，高表達(dá)EphA分子的前列腺癌細(xì)胞間相互接觸后可激活EphA類分子，促使細(xì)胞間相互排斥進(jìn)而使腫瘤擴(kuò)散，且通過RhoGTP酶實(shí)現(xiàn)其對細(xì)胞骨架的重構(gòu)。
　　 基于這樣的研究基礎(chǔ)，我們推測，作為一個(gè)這樣功能繁冗、機(jī)制復(fù)雜的受體蛋白，EphA4及其下游信號蛋白在CML的發(fā)生發(fā)展中特別是在與白血病細(xì)胞侵襲力相關(guān)的髓外浸潤中可能也具

9、有一定的作用與調(diào)節(jié)機(jī)制，這是一個(gè)值得研究的課題，其意義在于尋找對抗白血病髓外浸潤的治療靶點(diǎn)。K562來源于慢性髓系白血病紅白血病急性變患者，具有血管新生及浸潤的潛能，可選擇該細(xì)胞株用于研究EphA4在白血病發(fā)生發(fā)展中的轉(zhuǎn)移、浸潤的作用機(jī)制問題。本研究首先對髓系白血病原代細(xì)胞中EphA4受體的表達(dá)情況進(jìn)行了考察，進(jìn)而對K562中EphA4mRNA水平和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行初探，其后通過基因技術(shù)建立過表達(dá)EphA4的K562穩(wěn)定細(xì)胞株(K562

10、-EphA4)，觀察EphA4的過表達(dá)對其下游相關(guān)信號蛋白的影響，并以功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其髓外浸潤能力的改變。通過這些觀察，我們將對EphA4在CML中對下游信號的調(diào)控以及其與髓外浸潤的關(guān)系有所認(rèn)識，從而為白血病髓外浸潤行為尋找更有效的靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)，也有利于進(jìn)一步解決目前髓外白血病難治、復(fù)發(fā)的難題，對于白血病的防治具有積極的意義。
　　 [方法]
　　 1.收集臨床上無髓外浸潤與有髓外浸潤的髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，We

11、sternBlot檢測其EphA4蛋白的表達(dá)情況;培養(yǎng)慢性粒細(xì)胞白血病急紅變株K562細(xì)胞，于對數(shù)期生長期與正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測其EphA4的mRNA水平、WesternBlot檢測其EphA4蛋白表達(dá)水平。
　　 2.由于K562細(xì)胞中EphA4mRNA的表達(dá)豐度較低，故通過制備EphA4重組克隆并進(jìn)行測序、構(gòu)建慢病毒載體、包裝慢病毒并感染至K562細(xì)胞等一系列過程構(gòu)建過表達(dá)EphA4的K562穩(wěn)

12、定細(xì)胞株(K562-EphA4)，用于后續(xù)對EphA4下游信號蛋白的研究與功能學(xué)研究。
　　 3.WesternBlot檢測磷酸化RhoA蛋白與磷酸化Racl/cdc42蛋白在K562細(xì)胞與K562-EphA4細(xì)胞中的表達(dá)水平，以考察EphA4對于這三種蛋白活性的調(diào)節(jié)作用。
　　 4.通過體外遷移實(shí)驗(yàn)與體外侵襲實(shí)驗(yàn)對K562細(xì)胞與K562-EphA4細(xì)胞的侵襲力進(jìn)行比較，以考察這兩種細(xì)胞的髓外浸潤能力。
　　 [

13、結(jié)果]
　　 1.有髓外浸潤癥狀的髓系白血病患者其骨髓單個(gè)核細(xì)胞的EphA4蛋白表達(dá)水平高于無髓外浸潤癥狀的髓系白血病患者，二者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。K562細(xì)胞中EphA4的mRNA與蛋白水平均高于正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中EphA4的水平，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)EphA4蛋白的K562細(xì)胞株(K562-EphA4)。Westernblot檢測K562-E

14、phA4細(xì)胞的EphA4蛋白表達(dá)水平高于K562細(xì)胞，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.WesternBlot結(jié)果顯示，K562-EphA4細(xì)胞的磷酸化RhoA蛋白水平與磷酸化Racl/cdc42蛋白水平均高于K562細(xì)胞，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.體外遷移實(shí)驗(yàn)與體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，K562-EphA4細(xì)胞穿過微孔膜與基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量多于K562細(xì)胞，二者差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

15、(P＜0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.研究結(jié)果從兩方面驗(yàn)證了EphA4受體在侵襲力較高的白血病細(xì)胞中出現(xiàn)了相對較高的表達(dá)，提示我們EphA4受體可能對白血病細(xì)胞的侵襲力有所調(diào)控。同時(shí)結(jié)合大量相關(guān)文獻(xiàn)，我們認(rèn)為，研究EphA4在白血病細(xì)胞侵襲力方面的作用是具有一定意義的。
　　 2.已成功建立了過表達(dá)EphA4蛋白的K562穩(wěn)定細(xì)胞株（K562-EphA4細(xì)胞），為研究EphA4基因與蛋白在白血病發(fā)生及進(jìn)展

16、中的作用及機(jī)制建立了基礎(chǔ)。
　　 3.研究結(jié)果提示，EphA4的過表達(dá)上調(diào)了RhoA蛋白活性、Rac/Cdc42蛋白活性，推測RhoA、Racl、Cdc42可能為其下游信號蛋白。并基于大量文獻(xiàn)，我們推測EphA4可能通過調(diào)節(jié)RhoA、Racl/cdc42蛋白活性而對K562細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生一定的影響。
　　 4.體外遷移實(shí)驗(yàn)與體外侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，K562-EphA4細(xì)胞的遷移與侵襲能力高于K562細(xì)胞，提示EphA4的過