垂盆草提取物抗馬兜鈴酸所致腎纖維化分子機制的研究.pdf

1、[目的]：
　　腎纖維化是各種不同病因的慢性腎病進展到終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)。了解腎纖維化的分子機制，探索有效的防治措施，對延緩腎功能減退，延長患者壽命具有十分重要的意義。已有研究顯示，單核-巨噬細胞相關(guān)的炎癥反應(yīng)在腎纖維化發(fā)生過程中扮演著重要角色，抑制炎癥反應(yīng)可以有效抑制纖維化程度。然而，從抑制炎癥反應(yīng)的角度，查找潛在的抗纖維化藥物，目前相關(guān)研究較少。垂盆草提取物(SSBE)是一種新發(fā)現(xiàn)的具有抗炎功效的中草藥，但S

2、SBE是否可以通過抑制單核-巨噬細胞相關(guān)的炎癥反應(yīng)，從而達到抗腎纖維化的作用尚待進一步研究證實。
　　本研究從體外實驗角度，培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E，應(yīng)用不同濃度的馬兜鈴酸(AA)進行損傷實驗，并同時加或不加SSBE進行干預。我們的研究旨在:
　　1.闡明AA誘導腎小管上皮細胞NRK-52E損傷，上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生和細胞外基質(zhì)(ECM)形成的分子機制。
　　2.證實SSBE能抗AA誘導的腎纖

3、維化，并證實其抗腎纖維化作用是通過抑制單核-巨噬細胞相關(guān)炎癥因子的表達和釋放來達到的。
　　3.證實SSBE抗單核-巨噬細胞相關(guān)的炎癥反應(yīng)是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號的活化來實現(xiàn)的。
　　[方法]：
　　將體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)分為三個實驗組:①對照組:未加入SSBE和AA;②AA損傷組:AA濃度為1、10、100mg/L;③SSBE干預組:AA濃度為10 mg/L和SSBE濃度為

4、10、100、1000mg/L。培養(yǎng)24 h后，通過以下方法檢測:
　　1.采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化;
　　2.WST-1測定細胞增殖及毒性的變化;
　　3.Hoechst33258染色和流式細胞術(shù)檢測NRK-52E細胞的凋亡情況;
　　4.實時熒光定量PCR(real-time PCR)和Western blot檢測凋亡相關(guān)基因c-Myc和p53 mRNA和蛋白的表達;
　　5.實時熒光定量PC

5、R和細胞免疫熒光染色檢測ECM成分Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，上皮細胞標志物鈣黏蛋白(E-cadherin)，肌成纖維細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，及細胞表型轉(zhuǎn)化(EMT)抑制分子骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-7)mRNA和蛋白的表達;
　　6.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和細胞免疫熒光染色檢測巨噬細胞移動抑制因子(MIF)的表達;
　　7.實時熒光定量PCR和細胞免疫熒光染色檢測單核細胞趨化因子(MCP-1)和巨噬細胞集

6、落刺激因子(M-CSF)的表達;
　　8.Western blot檢測炎癥反應(yīng)重要信號通路中NF-κB p65的表達。
　　[結(jié)果]：
　　1.AA誘導NRK-52E細胞出現(xiàn)損傷、凋亡、壞死和異常增殖:倒置相差顯微鏡的觀察發(fā)現(xiàn)，AA能誘導NRK-52E細胞的損傷;且不同濃度的AA導致的損傷程度不同，Hoechst33258染色結(jié)果顯示，AA1 mg/L即可誘導細胞出現(xiàn)凋亡小體，AA10 mg/L時細胞凋亡特征最為典型，

7、而當AA高達100 mg/L時則主要表現(xiàn)為壞死。流式細胞術(shù)檢測也發(fā)現(xiàn)，10 mg/L的AA處理24 h后，NRK-52E細胞凋亡率明顯增加。同時，real-time PCR和western blot結(jié)果也顯示，AA作用后，p53和c-Myc mRNA和蛋白的表達增加。WST-1細胞活力和增殖檢測結(jié)果表明AA損傷NRK-52E細胞呈現(xiàn)時間和濃度的依賴性。
　　2.SSBE對AA誘導的細胞增殖和凋亡的影響:SSBE對NRK-52E細胞

8、的作用呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。倒置相差顯微鏡觀察到，10和100 mg/L的SSBE能明顯減輕AA誘導的NRK-52E細胞的損傷，但濃度為1000 mg/L時，SSBE可誘導細胞損傷，增殖的細胞數(shù)目明顯被抑制。Hoechst33258染色和流式分析顯示，10和100 mg/L的SSBE能降低晚期凋亡和壞死細胞的比例，但濃度為1000mg/L時，SSBE可增加早期凋亡細胞比例。
　　3.SSBE干預AA誘導的ECM成分的累積:細胞免疫熒光染

9、色結(jié)果顯示，AA作用24 h后NRK-52E細胞的Ⅲ型膠原蛋白表達明顯增多;real-time PCR結(jié)果也表明Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA的表達隨AA濃度的增加而增高;而SSBE卻能抑制Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA和蛋白的高表達。
　　4.SSBE干預AA誘導的腎小管上皮細胞EMT的發(fā)生:細胞免疫熒光染色和real-time PCR結(jié)果表明，10 mg/L的AA作用于NRK-52E細胞24 h后，E-cadherin mRNA和蛋白表達下調(diào)

10、，α-SMA mRNA和蛋白表達上調(diào)，并且EMT抑制分子BMP-7 mRNA表達下調(diào)。而SSBE干預后，上述改變被抑制。
　　5.SSBE干預AA誘導的單核-巨噬細胞相關(guān)炎癥因子的表達:ELISA和細胞免疫熒光染色檢測結(jié)果表明，MIF的表達隨著AA濃度的增高而增加;real-timePCR和細胞熒光免疫染色也觀察到MCP-1和M-CSF的表達在AA作用后呈濃度依賴性升高。而AA誘導的MIF、MCP-1和M-CSF這些炎癥因子的高表

11、達可被SSBE所抑制。
　　6.SSBE抑制AA對NF-kB信號的活化:Western blot檢測結(jié)果顯示，AA作用24 h后，NF-κB p65的表達明顯升高，而在濃度為10、100和1000 mg/L SSBE作用后，NF-κB p65的表達則下降。
　　[結(jié)論]：
　　1.AA可誘導腎小管上皮細胞凋亡，并引起異常增殖，發(fā)生纖維化樣改變。
　　2.AA可誘導腎小管上皮細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化(EMT)，形成了表達E