TNFα對(duì)腎固有細(xì)胞C3、TLR4表達(dá)及積雪草甙合大黃素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：腎小球腎炎是臨床上最常見(jiàn)的一類腎臟疾病。補(bǔ)體激活、促炎介質(zhì)合成等因素造成了腎小球腎炎的發(fā)生與發(fā)展，最終導(dǎo)致終末期腎衰。本課題將通過(guò)補(bǔ)體發(fā)揮作用的核心成分——C3（Complement component3）來(lái)探討積雪草甙合大黃對(duì)腎臟免疫的作用及其分子機(jī)制的研究，同時(shí)對(duì)參與天然免疫的Toll樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）在腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的基因和蛋白水平展開(kāi)研究，揭示其表達(dá)的改變與疾病發(fā)

2、生的關(guān)系，將使其在未來(lái)的慢性炎癥性疾病中成為治療的靶向，為 Toll樣受體激動(dòng)劑和拮抗劑的運(yùn)用，提供理論依據(jù)。該研究成功將為治療腎小球腎炎提供一種有效的藥物，有深入開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
　　方法：采用小鼠腎小球系膜細(xì)胞（Glomerular mesangial cells，MsC）、腎小管上皮細(xì)胞（Mouse tubular epithelial cells，mTEC）為研究對(duì)象，模型組以腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis f

3、actorα，TNFα）10ng/ml誘導(dǎo)，治療組在TNFα誘導(dǎo)的同時(shí)，以1、2、4μg/ml三種濃度的積雪草甙，0.1、0.2、0.4μg/ml三種濃度的大黃素以及上述三種濃度的積雪草甙合大黃素進(jìn)行干預(yù)，于24h后分別提取細(xì)胞 RNA及上清，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)mTEC C3和TLR4 mRNA的表達(dá)，酶聯(lián)免疫方法（

4、Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）分別檢測(cè)mTEC C3和TLR4蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：正常mTEC具有C3 mRNA和蛋白表達(dá)，經(jīng)TNFα誘導(dǎo)后C3表達(dá)明顯上調(diào)，隨著刺激濃度增加，各組C3 mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，存在劑量依賴關(guān)系，其中以10.0ng/ml濃度最為顯著，達(dá)到13.96±1.21 ng/105cell/24h；用積雪草

5、甙1μg/ml+大黃素0.1μg/ml干預(yù)，mTEC C3和TLR4 mRNA表達(dá)無(wú)明顯下降，當(dāng)積雪草甙濃度達(dá)2μg/ml、大黃素濃度達(dá)0.2μg/ml時(shí)，mTEC C3 mRNA表達(dá)明顯下降（與模型組比較P<0.05），TLR4 mRNA表達(dá)有所下降（與模型組比較P>0.05）；當(dāng)積雪草甙濃度達(dá)4μg/ml、大黃素濃度達(dá)0.4μg/ml時(shí)，mTEC C3和TLR4 mRNA表達(dá)均明顯下降（與模型組比較P<0.05-0.01）。C3蛋白

6、檢測(cè)表明，mTEC經(jīng)TNFα作用24h后，與正常組比較，含量顯著增加（P<0.01），經(jīng)三種不同濃度的積雪草甙合大黃素干預(yù)后，C3蛋白分別顯著下降（與模型組比較 P<0.05-0.01），有一定的量效依賴關(guān)系和協(xié)同作用；當(dāng)積雪草甙濃度達(dá)4μg/ml、大黃素濃度達(dá)0.4μg/ml時(shí)，TLR4蛋白表達(dá)亦顯著下降（與模型組比較P<0.05）。
　　結(jié)論：積雪草甙合大黃素能夠抑制炎性細(xì)胞因子TNFα上調(diào)所致的腎局部C3過(guò)度產(chǎn)生，減輕了局部