PRKDC、XRCC4多態(tài)性與中國安陽地區(qū)食管鱗癌發(fā)生風險關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、背景：
　　食管癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，食管癌導(dǎo)致的死亡率高居第六位。全球數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果提示，食管癌的分布具有明顯的地區(qū)、地域、民族差異，在我國、南非、沙特阿拉伯等國發(fā)病率較高，高、低發(fā)區(qū)發(fā)病率相差高達500倍。在中國北方，河南省、山東省、河北省交界處發(fā)病率明顯高于其他地方，尤其是河南安陽地區(qū)，每十萬人大約有32.22人次因為食管癌死亡，比食管癌低發(fā)區(qū)的云南發(fā)病率高30倍之多。
　　食管鱗癌的發(fā)病機制非常復(fù)

2、雜，是一個發(fā)生多環(huán)境因素參與、多基因變異及多階段逐步發(fā)生的過程。飲酒，吸煙，營養(yǎng)攝入不足，機體所處的環(huán)境和遺傳信息差別均與食管鱗狀細胞癌的發(fā)病率有關(guān)。其中遺傳信息的差別及食管鱗癌發(fā)病率之間的關(guān)系是研究的熱點之一。
　　在某種環(huán)境下長期生存的個體，由于環(huán)境的長期選擇作用，機體針對特定的環(huán)境特性形成相應(yīng)的基因點突變，此為個體遺傳物質(zhì)差異的重要表現(xiàn)，體現(xiàn)出單堿基突變水平的基本遺傳物質(zhì)的遺傳變異，此即單核苷酸多態(tài)性(SNP)。發(fā)生SNP的

3、類型和頻率具有明顯的種族，地域的差異，因此，常見于某地區(qū)或民族的SNP等位基因在其他地區(qū)或民族可能很少見，這些遺傳變異解釋了為何人體對疾病易感性、疾病的嚴重程度及治療效果存在差異。近年來，復(fù)雜性疾病的功能性SNP及對藥物、毒物反應(yīng)相關(guān)SNP的研究已經(jīng)取得進展，SNP在功能性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用也逐漸被揭示。
　　DNA雙鏈斷裂(DSB)是一種嚴重的DNA損傷形式，包括編碼基因的丟失，染色體缺失、重排、重組等變化均會對細胞造成嚴重后

4、果，隨后將導(dǎo)致細胞功能失常，從而引起細胞死亡或腫瘤的發(fā)生。而DSB損傷的修復(fù)主要是通過非同源末端連接修復(fù)(nonhomologous end joining，NHEJ)及同源重組修復(fù)(homologous recombination，HR)兩條途徑完成的。本研究所涉及的兩個基因PRKDC、XRCC4就是NHEJ通路的重要組成部分，其基因多態(tài)性可能與食管鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。
　　目的：
　　本研究針對環(huán)境與遺傳背景相對一致的食

5、管鱗癌患者以及與之相匹配的健康人群，采用候選基因的方法，應(yīng)用目前準確、高通量的DNA測序技術(shù)及PCR-RFLP技術(shù)檢測PRKDC及XRCC4基因多態(tài)性，探討他們與食管鱗癌發(fā)病相關(guān)聯(lián)的遺傳易感因素，為人群中高危個體的篩選、實施有針對性的干預(yù)、預(yù)防等措施，降低食管鱗癌的發(fā)生提供重要的理論依據(jù)。
　　方法：
　　本研究采用病例-對照的研究方法，收集在河南省安陽腫瘤醫(yī)院住院的食管鱗癌患者共189例，平均年齡60.23±7.91歲，所

6、有病例均經(jīng)胃鏡檢查病理活檢或手術(shù)切除后病理組織學檢查確診為食管鱗狀細胞癌;所有標本采集于術(shù)前并且未經(jīng)放療或化療。對照為189例健康對照者，平均年齡59.40±7.86歲，均為長期居住在河南安陽地區(qū)的漢族人群、體檢健康、無自身免疫性疾病及腫瘤史。所有研究對象均同意和自愿參加該項研究。
　　患者入組后由專人詢問收集病例組及對照組每個研究對象詳細的人口學資料、吸煙史、飲酒史及家族史的情況。所有研究對象均于入組次日晨空腹抽取靜脈血5ml保

7、存于抗凝試管內(nèi)，置于-20℃冰箱保存待測提取DNA，最后統(tǒng)一嚴格按照實驗程序提取外周血DNA。查詢NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）得到NHEJ修復(fù)通路中PRKDC、XRCC4基因完整的基因組序列，根據(jù)文獻并利用Haploview軟件選擇PRKDC基因的rs7003908位點及XRCC4基因的rs1805377位點進行研究，所選的SNPs最小等位基因頻率大于10％。采用RFLP法及DNA直接測序法

8、對所有研究對象的各個位點進行基因型檢測。
　　進行酶切反應(yīng)后，從酶切結(jié)果確定的各基因型中選擇10個樣本的PCR擴增原液樣品采用DNA測序的方法明確目標基因片段的堿基順序，兩種檢測結(jié)果相互印證，以證明RFLP結(jié)果的可靠性。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差、頻數(shù)、頻率和百分比表示。利用統(tǒng)計學軟件STATA.11以卡方檢驗驗證基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。如符合則納入統(tǒng)計分析，采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0，使用獨立樣本t檢驗

9、，對病例組和對照組的年齡進行方差齊性分析。對性別、年齡1:1配對的病例組和對照組利用單因素條件logistic回歸分析法比較吸煙史、飲酒史、食管癌家族史及rs1805377(XRCC4)、rs7003908（PRKDC）基因多態(tài)位點的分布差異。如有顯著統(tǒng)計學差異，則納入條件多變量Logistic回歸法分析，回歸法分析計算的得數(shù)稱為比值比(OR)，一般臨床采取其95％可信區(qū)間(CI)，在此區(qū)間的數(shù)值越大，表示根據(jù)SNP計算出的人口學因素及

10、基因型與食管鱗癌風險之間的相關(guān)性越強。實驗所進行的相關(guān)的統(tǒng)計檢驗均進行雙側(cè)概率檢驗，統(tǒng)計結(jié)果P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01表明有明顯統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)果：
　　1、通過單因素條件logistic回歸分析結(jié)果可見:食管鱗癌組吸煙個體87例，占46.0％，而對照組僅72例，食管鱗癌組高于對照組(38.1％)(P＜0.05），經(jīng)過年齡、性別校正，結(jié)果顯示OR=1.882，95％ CI=1.045～3.390，有明顯

11、統(tǒng)計學意義;
　　2、食管鱗癌組飲酒個體54例(28.6％)，明顯高于對照組39例(20.6％)(P＜0.05)，統(tǒng)計顯示經(jīng)過年齡、性別校正OR值為1.75，95％ CI介于1.010～3.031之間;
　　3、食管鱗癌組有食管癌家族史個體68例(36.0％)，明顯高于對照組41例(21.7％)(P＜0.05），經(jīng)年齡、性別校正OR=1.929，95％ CI=1.222～3.044，表明食管癌家族史在病例組及對照組差異有統(tǒng)計

12、學意義。
　　4、在XRCC4基因rs1805377、PRKDC基因rs7003908這兩個位點均發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性。其基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。
　　5、XRCC4基因rs1805377多態(tài)位點處AA基因型為野生型，AG和GG為突變型，與A/A基因型相比，A/G基因型和攜帶G等位基因的基因型(A/G+G/G)均不改變食管鱗癌的發(fā)病風險，經(jīng)吸煙、飲酒、家族史等混雜因素校正后的OR值

13、分別為0.933(95％CI=0.620～1.406)、0.818(95％CI=0.392～1.707)和0.878(95％CI=0.585～1.319)，結(jié)果顯示各基因型頻率分布在兩組間無顯著性差異。
　　6、rs7003908(PRKDC)多態(tài)位點AA基因型為野生型，AC和CC為突變型，病例組中CC基因型頻率顯著高于對照組(P=0.013)，經(jīng)吸煙、飲酒和家族史等混雜因素校正的OR=3.637，95％CI=1.313-10.0

14、72。且吸煙、飲酒與基因多態(tài)性位點之間及各基因多態(tài)性位點之間不存在交互作用(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、吸煙、飲酒、食管癌家族史分別作為獨立危險因素，可以顯著增加食管鱗癌的發(fā)病風險。
　　2、在XRCC4基因rs1805377位點及PRKDC基因rs7003908位點均發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性。
　　3、XRCC4基因rs1805377位點及PRKDC基因rs7003908位點基因型頻率分布均符合Hardy-