川椒方對變態(tài)反應(yīng)性結(jié)膜炎肥大細(xì)胞的影響及機(jī)制研究.pdf

1、一、理論研究
　　變態(tài)反應(yīng)性結(jié)膜炎(allergic conjunctivitis，AC)是眼科常見病之一，主要屬于肥大細(xì)胞和IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)性疾病。臨床上，本病多伴隨過敏性鼻炎、過敏性哮喘等疾病發(fā)生。目前，AC治療以局部用藥為主，肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑和抗組胺藥物，短期療效較好，遠(yuǎn)期療效欠佳。使用免疫抑制劑和激素類藥物，可以迅速控制病情，但療效有限，長期用藥，可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。由于該病發(fā)病率高、病程長、易反復(fù)發(fā)作、療效有限，已

2、屬眼科難治性疾病之一。
　　眼是全身器官之一，眼局部參與系統(tǒng)超敏反應(yīng)。動物模型證實雞卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的系統(tǒng)超敏反應(yīng)可出現(xiàn)眼部過敏癥狀。AC主要屬Ⅰ型超敏反應(yīng)，且AC患者多伴有過敏性鼻炎、過敏性哮喘等系統(tǒng)反應(yīng)。說明AC屬系統(tǒng)反應(yīng)在眼部的表現(xiàn)，治療應(yīng)從整體出發(fā)。
　　川椒方是全國名老中醫(yī)高健生研究員治療AC的經(jīng)驗方，他在中醫(yī)哲學(xué)思想指導(dǎo)下，根據(jù)中醫(yī)理論，結(jié)合近十年的臨床探索，并有所發(fā)展，認(rèn)為AC的病機(jī)

3、為“寒熱相搏”，在此基礎(chǔ)上形成了川椒方。川椒方由蛇床子、防風(fēng)、荊芥、知母、地膚子、川椒、川芎等組成。課題組前期臨床證實，川椒方能明顯緩解眼癢、減輕結(jié)膜充血，且療效明顯優(yōu)于肥大細(xì)胞(mast cell，MC)穩(wěn)定劑色甘酸鈉滴眼液和既能穩(wěn)定肥大細(xì)胞又能抗組胺的奧洛他定滴眼液。又因川椒方為口服給藥，還可以緩解過敏性鼻炎癥狀。同時，動物實驗也證實川椒方可以減輕OVA誘導(dǎo)的小鼠AC急性期癥狀，降低小鼠血清IgG1，IgE，IL-4水平，減少結(jié)膜內(nèi)

4、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞趨化聚集，以及肥大細(xì)胞數(shù)量，抑制其脫顆粒。說明川椒方可以穩(wěn)定MC，抑制其脫顆粒。圍繞“治療和防止AC復(fù)發(fā)”這兩大目標(biāo)，本研究旨在探討川椒方對MC的影響及作用機(jī)制，為臨床推廣奠定實驗基礎(chǔ)，同時為“寒熱相搏”這一理論提供實驗佐證。
　　二、實驗研究
　　1.目的：
　　在前期研究證實川椒方能有效治療AC的基礎(chǔ)上，圍繞川椒方具有“穩(wěn)定肥大細(xì)胞、抑制其脫顆?！钡淖饔?，通過不同層次的功能和機(jī)制研究，觀察川

5、椒方對MC脫顆粒過程的影響，并探討川椒方“穩(wěn)定肥大細(xì)胞、抑制其脫顆粒”的作用機(jī)制。
　　2.方法：
　　(1)將84只Balb/c小鼠隨機(jī)分為7組，即正常組、模型組（不給藥）、陰性對照組（給予生理鹽水灌胃）、川椒方水煎劑低中高劑量組（分別給予川椒方5.25，10.5，21.0 g·kg-1灌胃，每天1次，灌胃體積均為10 mL· kg-1）、奧洛他定滴眼液(0.1％)治療組，每組各12只。用雞卵清白蛋白免疫小鼠建立變應(yīng)性結(jié)膜

6、炎模型。裂隙燈觀察小鼠急性期癥狀變化;甲苯胺藍(lán)染色，計算結(jié)膜組織中MC數(shù)量及脫顆粒率;ELISA檢測小鼠血清中前列腺素D2(PGD2)、P物質(zhì)(SP)、組胺(HIS)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達(dá)水平;免疫組化檢測結(jié)膜組織中SP表達(dá);RT-PCR檢測結(jié)膜組織中白介素(IL-4)和TNF-α的表達(dá)。
　　(2)分別給予含川椒方生藥6.68，13.36，26.71 g·kg-1的水煎劑，灌胃體積均為20mL· kg-1，每日2次，

7、連續(xù)給藥3d?？瞻籽褰M給予等量的0.9％氯化鈉溶液。制備SD大鼠含藥血清，HPLC鑒定川椒方含藥血清中是否存有川椒方君藥蛇床子主要成分蛇床子素;MTT法檢測各含藥血清組對RBL-2H3細(xì)胞的最佳作用濃度。
　　(3)采用anti-DNP IgE抗體聯(lián)合DNP-BSA抗原刺激RBL-2H3細(xì)胞，復(fù)制細(xì)胞脫顆粒模型。利用酶底物法檢測β-氨基己糖苷酶釋放量。通過β-氨基己糖苷酶釋放量，確定最佳抗體濃度、抗原作用時間以及含藥血清最佳作用

8、時間。
　　(4)建立RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒模型。采用甲苯胺藍(lán)染色法，觀察RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒數(shù)量和脫顆粒率;ELISA檢測β-氨基己糖苷酶釋放率，檢測RBL-2H3細(xì)胞分泌IL-4和TNF-α的情況;運用real time-PCR檢測IL-4和TNF-α mRNA表達(dá)水平;運用western blot技術(shù)，檢測MC脫顆粒過程中重要蛋白p-AKT，p-ERK，p-p38，p-JNK水平。
　　3.結(jié)果：
　　(1

9、)與正常組相比，模型組和陰性對照組臨床癥狀評分顯著升高（P＜0.01），結(jié)膜肥大細(xì)胞聚集，脫顆粒明顯(P＜0.01);血清中SP、PGD2、HIS和TNF-α的表達(dá)升高(P＜0.01)，結(jié)膜組織中SP，IL-4和TNF-α的表達(dá)升高(P＜0.01)。與模型組比較，各治療組癥狀評分顯著降低(P＜0.01)，各治療組療效相當(dāng)（P＞0.05）。結(jié)膜組織中肥大細(xì)胞數(shù)量減少，脫顆粒率下降(P＜0.01);血清中SP，PGD2，HIS和TNF-α的

10、表達(dá)顯著降低(P＜0.01);結(jié)膜組織中SP，IL-4和TNF-α的表達(dá)明顯降低(P＜0.01）。各治療組療效相當(dāng)(P＞0.05)，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的改善臨床癥狀體征的作用。
　　(2) HPLC結(jié)果顯示蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品溶液與川椒方含藥血清溶液保留時間在6.15-6.55min之間?？瞻籽迦芤涸诖藭r間段內(nèi)無明顯吸收峰;MTT法提示川椒方各組、空白血清組對細(xì)胞活力的影響與作用時間有關(guān)。在一定的時間內(nèi)(48h)，隨作用時間延長，抑制細(xì)胞活

11、力的能力逐漸提高，此后(72h)，有效作用濃度下降，對細(xì)胞活力影響不大。分析各血清組濃度對細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)四組細(xì)胞活力較好的作用濃度多為10％，結(jié)合血清細(xì)胞毒性實驗，細(xì)胞在10％濃度藥物血清中活力較好，本實驗選擇了10％濃度血清作為實驗濃度。
　　(3)根據(jù)酶底物法檢測β-氨基己糖苷酶釋放量的多少，發(fā)現(xiàn)抗體濃度為25μg·L-1時，釋放量最大，明顯高于其他各組(P＜0.01); DNP-BSA作用15 min時，釋放量最大，明

12、顯高于其他各組(P＜0.01);川椒方高、中劑量組含藥血清作用120min時，釋放量最少(P＜0.01)。
　　(4)與正常組相比，模型組和陰性對照組肥大細(xì)胞脫顆粒明顯(P＜0.01);β-氨基己糖苷酶釋放率升高明顯(P＜0.01); RBL-2H3細(xì)胞分泌IL-4和TNF-α增多(P＜0.01); IL-4和TNF-α mRNA表達(dá)增高(P＜0.01); p-AKT，p-ERK，p-p38，p-JNK表達(dá)增加(P＜0.01)。與

13、模型組和陰性對照組比較，各治療組肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象明顯抑制(P＜0.01);β-氨基己糖苷酶釋放率下降(P＜0.01); RBL-2H3細(xì)胞分泌IL-4和TNF-α減少(P＜0.01);IL-4和TNF-α mRNA表達(dá)下降(P＜0.01); p-AKT，p-ERK，p-p38，p-JNK表達(dá)下降(P＜0.01)。川椒方抑制肥大細(xì)胞脫顆粒作用與濃度呈正相關(guān)。
　　4.結(jié)論：
　　(1)川椒方能夠治療變態(tài)反應(yīng)性結(jié)膜炎，其作用機(jī)