細(xì)胞骨架蛋白MICAL-L2和ACTN4在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、目的:通過對上皮性卵巢癌組織和細(xì)胞的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究,探討細(xì)胞骨架蛋白MICAL-L2及其相互作用蛋白α-輔肌蛋白4(ACTN4)在卵巢癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及可能機(jī)制。
　　方法:(1)用免疫組化法檢測人上皮性卵巢癌組織芯片中 MICAL-L2蛋白的表達(dá),探討 MICAL-L2與人卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系。(2)利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定干擾 MICAL-L2的人卵巢癌細(xì)胞株,采用 CCK8方法、劃痕實(shí)驗(yàn)、空穿實(shí)驗(yàn)、膠穿

2、實(shí)驗(yàn)等方法檢測干擾MICAL-L2后對細(xì)胞增殖,遷移及侵襲功能的影響。(3)利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測干擾MICAL-L2后細(xì)胞形態(tài)變化及EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的變化。(4)利用western blotting方法檢測EMT相關(guān)分子標(biāo)志物及下游通路中相關(guān)分子在干擾MICAL-L2組和對照組中的變化情況。(5)利用RT-PCR方法檢測EMT過程中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化。(6)利用熒光素酶報(bào)告基因檢測 Wnt通路中TOP/FOP的活性變化情況。(7

3、)利用 RT-PCR方法及 siRNA干擾方法初步驗(yàn)證MICAL-L2與ACTN4的相互作用關(guān)系。(8)利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析ACTN4與卵巢癌預(yù)后之間的關(guān)系。(9)利用MTT和流式細(xì)胞術(shù)的方法分析ACTN4與卵巢癌耐藥的關(guān)系及可能機(jī)制。
　　結(jié)果:(1)MICAL-L2在上皮性卵巢癌中的高表達(dá)率(68.60％)明顯高于正常對照組(16.67％),差異有顯著性(P<0.0001)。MICAL-L2在卵巢癌 III-IV期中的高表達(dá)

4、率(81.40％)顯著高于 I-II期(55.81％)(P=0.011);在組織學(xué)分級為 G2、G3中的高表達(dá)率顯著高于G1期(P=0.009)。(2)穩(wěn)定干擾MICAL-L2基因后,與對照組比較,細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯減弱,差異有顯著性(p值均<0.01)。(3)細(xì)胞免疫熒光檢測F-actin、上皮分子標(biāo)志物E-cadherin、間質(zhì)分子標(biāo)志物vimentin發(fā)現(xiàn),干擾穩(wěn)定 MICAL-L2后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生重要變化,由梭形變?yōu)閳A

5、形,細(xì)胞與細(xì)胞間連接更加緊密,上皮分子標(biāo)志物E-cadherin明顯增多,間質(zhì)分子標(biāo)志物vimentin表達(dá)明顯下降。(4)western blotting結(jié)果顯示:上皮分子標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)升高,間質(zhì)分子標(biāo)志物vimentin表達(dá)明顯下降,胞核中β-catenin表達(dá)明顯降低,胞漿中無變化,p-β-catenin無變化,Wnt/β-catenin通路下游Cyclin-D1表達(dá)降低。(5) RT-PCR方法檢測EMT轉(zhuǎn)錄因子

6、SNAIL、SLUG、TWIST、ZEB1和ZEB2在干擾MICAL-L2組和對照組變化,結(jié)果顯示干擾MICAL-L2后SNAIL和SLUG無變化,TWIST、ZEB1和ZEB2在mRNA水平表達(dá)明顯降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(6)TOP/FOP熒光素酶報(bào)告基因檢測Wnt通路中轉(zhuǎn)錄活性的變化,結(jié)果顯示干擾MICAL-L2后TOP活性較對照組明顯降低,FOP活性無明顯變化。(7)RT-PCR方法及siRNA干擾方法分析MICAL

7、-L2與ACTN4的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)MICAL-L2的細(xì)胞株中ACTN4表達(dá)也相應(yīng)較高,瞬時(shí)干擾MICAL-L2后ACTN4表達(dá)也明顯降低(8)TCGA數(shù)據(jù)庫分析 ACTN4與卵巢癌患者預(yù)后明顯相關(guān),ACTN4基因改變的患者預(yù)后較差,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(9)轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA的卵巢癌細(xì)胞對化療藥紫杉醇敏感性增加(P<0.05),凋亡率增加(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、卵巢癌組織中MICA

8、L-L2高表達(dá)與卵巢癌臨床分期和組織學(xué)分級有關(guān)。
　　2、MCIAL-L2可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲。
　　3、MICAL-L2能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。
　　4、激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路以及促進(jìn)Rac1的活化可能是MICAL-L2引起卵巢癌細(xì)胞EMT的發(fā)生的機(jī)制之一
　　5、ACTN4與卵巢癌不良預(yù)后關(guān)系密切,其可能通過抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡參與對紫杉醇的化療抵抗。
　　6、抑制