復(fù)方牛胎肝提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝組織Toll樣受體-4、核因子-kBp65表達(dá)的影響.pdf

1、目的:多種原因可引起慢性的持續(xù)性的肝臟損傷。最常見的病因有慢性乙型病毒性肝炎、慢性丙型病毒性肝炎及酒精性肝病，此外藥物性肝炎、自身免疫性肝病等亦非罕見。而長(zhǎng)期的反復(fù)的肝臟炎癥損傷及再生修復(fù)過程將導(dǎo)致肝纖維化(Hepatic fibrosis)及肝硬化(Hepatic cirrhosis)，甚至肝癌，從而嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量、威脅患者生命。因此延緩、終止甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化對(duì)慢性肝病患者及臨床工作者而言有著重大意義。目前研究表明肝纖維化并非完

2、全不可逆，研究肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找肝纖維化新的治療靶點(diǎn)正為廣大科研及臨床工作者密切關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過通過初步觀察復(fù)方牛胎肝提取物治療前后，肝纖維化大鼠肝組織Toll樣受體-4(Toll like receptor-4，TLR4)、核因子-κBp65（Nuclear factor-kappaBp65，NF-κBp65）表達(dá)水平的變化及肝組織纖維化程度的變化，對(duì)復(fù)方牛胎肝提取物的抗纖維化機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法:將60只清潔

3、級(jí)健康SD(Sprague Dawley)大鼠分為對(duì)照組、模型組各12只，治療組36只，再按復(fù)方牛胎肝提取物治療劑量不同分別分為大、中、小劑量治療組。模型組及治療組的造模方法為將四氯化碳(CCL4)與橄欖油配成40％油劑，按0.3ml/100g體重皮下注射，2次/周，模型處理持續(xù)12周，對(duì)照組同時(shí)注射等量生理鹽水。在4周末，將治療組大鼠按復(fù)方牛胎肝提取物治療劑量不同，分為大、中、小劑量治療組。復(fù)方牛胎肝提取物大、中、小劑量治療組按每公斤

4、體重相當(dāng)臨床劑量的20、10、5倍灌胃，1次/d，連續(xù)治療8周，模型組及正常組以等滲鹽水代替。大鼠均于12周時(shí)經(jīng)10％水合氯醛0.3mL/kg麻醉后，門靜脈采血3-5ml，1500r/min離心5min，離心半徑10cm，取上清液，測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、透明質(zhì)酸(HA)的表達(dá)變化。另開腹取肝臟組織，部分肝臟組織以10％中性甲醛溶液固定，石蠟包埋后制備十來張病理切片。HE及Masson染色后顯微鏡

5、下觀察及評(píng)估肝組織病理變化。其余肝組織迅速置于液氮凍存，RT-PCR法檢測(cè)各組肝組織TLR-4及NF-KBp65mRNA的表達(dá)。WB檢測(cè)各組肝組織TLR-4及NF-KBp65mRNA蛋白表達(dá)水平。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、四氯化碳溶液成功誘導(dǎo)出大鼠肝纖維化模型:造模4周時(shí)即可見模型組及

6、治療組大鼠血清中ALT、AST水平比對(duì)照組明顯升高，HA水平呈同樣趨勢(shì)。肝組織切片病理學(xué)觀察見正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維結(jié)締組織增生明顯，自匯管區(qū)向外延伸分隔，部分視野可見假小葉。復(fù)方牛胎肝提取物治療后以上血清學(xué)指標(biāo)水平逐漸下降，大劑量治療組降低最為顯著。且模型組及治療組各血清學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、RT-PCR結(jié)果顯示:正常組TLR4、NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平較低，肝纖維化模型組表達(dá)水平

7、最高，復(fù)方牛胎肝提取物治療組表達(dá)較模型組表達(dá)減少，各組之間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為521.48，693.61，1409.38，22.76;均P＜0.01)
　　3、蛋白定量結(jié)果顯示:通過Western蛋白印跡法檢測(cè)治療組及模型組TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)量均明顯高于正常組，具有明顯差異（F值分別為15.76，12.29，均p≤0.01）。
　　結(jié)論:
　　TLR4及NF-kBp65mRNA及蛋白在正常肝