六溴環(huán)十二烷(HBCD)和菲(PHE)對(duì)菲律賓蛤仔毒性效應(yīng)與污染檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，大量的污染物從陸地涌入近海，我國(guó)面臨著海洋污染這個(gè)環(huán)境問(wèn)題的巨大挑戰(zhàn)。污染物在海洋生物體內(nèi)的累積效應(yīng)不僅會(huì)危及生物體本身，通過(guò)食物鏈傳遞最終可能會(huì)威脅人類的健康。
　　六溴環(huán)十二烷（HBCD）是一種應(yīng)用廣泛的溴系阻燃劑，被發(fā)現(xiàn)在環(huán)境和動(dòng)物體內(nèi)普遍存在，由于其具有蓄積性和持久性，被認(rèn)為是潛在的持久性有機(jī)污染物（POPs）。多環(huán)芳烴（PAHs）是一類持久性有機(jī)污染物，隨著海洋PAHs污染日益加劇，其對(duì)海洋生

2、物的毒性研究已成為熱點(diǎn)問(wèn)題。菲（PHE）是具有灣結(jié)構(gòu)和K區(qū)域的最小的多環(huán)芳烴分子，所以常被作為研究多環(huán)芳烴的模式化合物。為了研究HBCD和PHE對(duì)水生動(dòng)物的毒性效應(yīng)和它們?cè)诃h(huán)境樣品中的監(jiān)測(cè)方法，我們開展了一系列工作。本研究以我國(guó)淺海重要經(jīng)濟(jì)貝類菲律賓蛤仔（Venerupis philippinarum）為研究對(duì)象，研究了HBCD和PHE對(duì)菲律賓蛤仔的亞慢性毒性效應(yīng)（解毒代謝系統(tǒng)，抗氧化防御系統(tǒng)和大分子損傷），通過(guò)構(gòu)建差異消減文庫(kù)的方法篩

3、選分子水平生物標(biāo)志物，并采用酶聯(lián)免疫方法（ELISA）初步建立了檢測(cè)環(huán)境中菲含量的靈敏快速的試劑盒方法，為海洋環(huán)境污染監(jiān)測(cè)和水產(chǎn)品安全評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。
　　1.六溴環(huán)十二烷（HBCD）對(duì)菲律賓蛤仔毒性效應(yīng)與生物標(biāo)志物篩選的研究
　　為了研究HBCD對(duì)菲律賓蛤仔的毒性效應(yīng)，本章測(cè)定了以下幾種生物標(biāo)志物的變化(i)解毒代謝酶（EROD, GST, SOD）；(ii)非酶抗氧化小分子（GSH）;(iii)氧化壓力指標(biāo)（LPO,

4、DNA損傷）。HBCD脅迫（0.086,0.86,8.6μg/L）后1-,3-,6-,10-,15d取樣。結(jié)果表明鰓絲和消化盲囊組織中解毒代謝酶在不同處理組中均被誘導(dǎo)，且消化盲囊比鰓變化敏感。鰓和消化盲囊組織中的EROD和GST活性的峰值均出現(xiàn)在第10天，被極顯著誘導(dǎo)(p<0.01)。鰓中SOD活性隨濃度升高而增強(qiáng)，消化盲囊SOD值在第10天后出現(xiàn)高濃度處理組較中濃度處理組低的現(xiàn)象。兩種組織中GSH含量均表現(xiàn)出時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)。鰓和消

5、化盲囊的DNA損傷程度與染毒濃度呈負(fù)相關(guān)。F值在實(shí)驗(yàn)前6天逐漸下降至最低值，然后DNA啟動(dòng)了自我修復(fù)機(jī)制，6天后至實(shí)驗(yàn)結(jié)束又逐漸上升。鰓和消化盲囊中MDA含量均于第6天出現(xiàn)峰值?？偠灾煌M織不同生物標(biāo)志物的變化趨勢(shì)不同，這與污染物的種類、濃度和取樣時(shí)間有關(guān)。GSH的線性變化關(guān)系良好，可以考慮作為HBCD污染脅迫下蛤仔體內(nèi)生理生化指標(biāo)變化的標(biāo)志物。從各個(gè)生物標(biāo)志物在污染脅迫下受到不同程度損傷可以看出，HBCD在環(huán)境相關(guān)濃度下對(duì)雙殼貝

6、類具有毒性效應(yīng)。該結(jié)果可以為HBCD的環(huán)境毒性評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持。
　　利用抑制性消減雜交（SSH）技術(shù)構(gòu)建了HBCD（8.6μg/L）脅迫下菲律賓蛤仔鰓組織正、反向cDNA消減文庫(kù)，共得到800個(gè)克隆，其中315個(gè)單克隆。正向文庫(kù)158個(gè)單克隆，核苷酸平均長(zhǎng)度473.35bp，基因新型率40.10％；反向文庫(kù)157個(gè)單克隆，核苷酸平均長(zhǎng)度450.46bp，基因新型率48.60%。GenBank序列號(hào)為 JK729382-JK729

7、426。利用序列分析軟件BlastX和BlastN對(duì)單一基因進(jìn)行功能分類，正向文庫(kù)包含11個(gè)功能大類，反向文庫(kù)包含9個(gè)功能大類。根據(jù)基因的新型率和與免疫、解毒代謝過(guò)程相關(guān)的原則，采用熒光定量PCR技術(shù)（脅迫濃度0.086,0.86 and8.6μg/L，取樣時(shí)間3d，10d）進(jìn)一步分析9個(gè)目的基因的表達(dá)情況：與免疫相關(guān)的蛋白（血藍(lán)蛋白亞基2，C型凝集素3）；壓力和調(diào)控蛋白（鐵蛋白，細(xì)胞延長(zhǎng)因子1-α）；代謝相關(guān)蛋白（NADH脫氫酶，細(xì)胞

8、色素c氧化酶，磷酸乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶，過(guò)氧化氫酶，二氫二醇脫氫酶）。這些差異表達(dá)基因可以作為海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)的分子生物標(biāo)志物的候選基因。
　　2.多環(huán)芳烴—菲（PHE）對(duì)菲律賓蛤仔毒性效應(yīng)與生物標(biāo)志物篩選的研究
　　菲對(duì)菲律賓蛤仔的脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同濃度處理組鰓和消化盲囊組織中解毒代謝酶活性均被不同程度誘導(dǎo)，消化盲囊組織比鰓變化明顯。兩種組織中EROD活性于3天后被顯著誘導(dǎo)。高濃度處理組EROD活性呈現(xiàn)先激活后抑制的現(xiàn)象

9、。GST活性在鰓和消化盲囊中的峰值分別出現(xiàn)在第10天和第6天，然后隨濃度增大，GST數(shù)值反而降低。低濃度處理組SOD活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，高濃度處理組SOD峰值出現(xiàn)在第6天，之后逐漸下降，但是與對(duì)照組相比誘導(dǎo)程度仍然顯著(p＜0.05)。GSH含量在鰓和消化盲囊中均表現(xiàn)出明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)。兩種組織中DNA損傷程度與染毒濃度呈負(fù)相關(guān)。F值3天時(shí)高濃度處理組表現(xiàn)出極顯著下降，然后逐漸恢復(fù)正常。鰓中MDA含量6天時(shí)顯著上升(p＜0.05)