淫羊藿甙對(duì)人工關(guān)節(jié)假體松動(dòng)的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、目的：分別從細(xì)胞水平、分子水平及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來探討淫羊藿甙對(duì)假體松動(dòng)的防治作用及其機(jī)制。 方法：1細(xì)胞水平：(1)探討Ti微粒對(duì)體外培養(yǎng)的新生大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響及淫羊藿甙對(duì)其保護(hù)作用。取體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞，一組加入0.1％(體積比)的Ti微?；鞈乙?，另一組為淫羊藿甙共培養(yǎng)后的成骨細(xì)胞加0.1％(體積比)的Ti微?；旌吓囵B(yǎng)，并于培養(yǎng)后24小時(shí)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)成骨細(xì)胞的凋亡情況，透射電鏡觀察成骨細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)變化。Ti微粒

2、可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡；用淫羊藿甙處理3天后的成骨細(xì)胞可部分對(duì)抗Ti微粒致細(xì)胞損傷作用。淫羊藿甙對(duì)Ti微粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡具有部分保護(hù)作用。(2)觀察淫羊藿甙對(duì)關(guān)節(jié)磨屑刺激單核細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6、PGE2、TNF的影響。分離培養(yǎng)兔外周血單核細(xì)胞，分成4組：D組：關(guān)節(jié)磨屑組，培養(yǎng)細(xì)胞中加入超高分子的聚乙烯顆粒(ultrahighmolecularweightpolyethylene,UHMWPE)。A組：D+10mg/ml的淫羊藿

3、甙。B組：D+1mg/ml的淫羊藿甙。C組：D+0.1mg/ml的淫羊藿甙。用放射免疫測(cè)定法測(cè)量各上清中PGE2及TNF含量。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定各上清中IL-1β及IL-6含量。 2分子水平：研究淫羊藿甙對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞OPNmRNA和Ⅰ型膠原表達(dá)的影響。從新生的SD大鼠的顱骨中，通過酶消化法分離出成骨細(xì)胞，放置于MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其形態(tài)通過倒置顯微鏡觀察，并通過ALP染色加以鑒定。成骨細(xì)胞采用24孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)分

4、四組進(jìn)行，分別設(shè)為A，B，C，D，每組6孔。A，B，C組分別用終濃度為0.1mg/ml，1mg/ml，10mg/ml的淫羊藿甙注射液進(jìn)行干預(yù)，均在第5d提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。D組用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，不用藥物干預(yù)，于第5d提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。其對(duì)于成骨細(xì)胞增殖和分化的影響通過MTT比色實(shí)驗(yàn)、BGP含量的放免法檢測(cè)以及用熒光二抗的免疫組化實(shí)驗(yàn)測(cè)定Ⅰ型膠原的表達(dá)來進(jìn)行；用RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞的OP

5、NmRNA的表達(dá)并進(jìn)行定量分析。 3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將30只成年新西蘭兔隨機(jī)分成三組。分陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和用藥防治組，各10只，雌雄各半，手術(shù)方法行模擬膝關(guān)節(jié)假體置換，6周后陽性對(duì)照組和用藥防治組向膝關(guān)節(jié)注射鈦微粒懸液，陰性對(duì)照組注射生理鹽水。用藥防治組隔日注射淫羊藿甙1mg/膝，其余兩組不與任何藥物自由飲水?dāng)z食。16周后處死動(dòng)物，取股骨下段作脫鈣切片，HE染色后光鏡下觀察假體周圍的病理變化；取膝關(guān)節(jié)囊研磨勻漿離心后測(cè)上清液中IL

6、-1β和TNF含量。股骨及脛骨連同植入物取出后，在相同條件下(片距70CM，暴光時(shí)間5S)攝取X線正位照片，選用脛骨側(cè)攝片輸入計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)，定量分析脛骨側(cè)植入物周圍3MM厚度骨組織密度值[灰度值]，進(jìn)行比較。 結(jié)果：1.(1)Ti微?？烧T導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡；用淫羊藿甙注射液處理3天后的成骨細(xì)胞可部分對(duì)抗Ti微粒致細(xì)胞損傷作用。(2)和D組比較，A、B、C三組各與假體松動(dòng)相關(guān)細(xì)胞因子含量均明顯下降，且與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)。2.淫羊

7、藿甙注射液對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞OPNmRNA表達(dá)有明顯促進(jìn)作用，其作用強(qiáng)度隨濃度而改變。3.和陰性對(duì)照組、用藥防治組比較，陽性對(duì)照組中檢測(cè)的IL-1β和TNF明顯增高，用藥防治組和陰性對(duì)比組比較無顯著差異，兩組脛骨灰度值無顯著差異。 結(jié)論：淫羊藿甙對(duì)Ti微粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡具有部分保護(hù)作用?？梢越档图袤w周圍炎性細(xì)胞因子的含量，促進(jìn)成骨細(xì)胞基因表達(dá)，從而防治假體松動(dòng)的產(chǎn)生。 第一部分淫羊藿甙注射液對(duì)Ti微粒誘導(dǎo)新生大

8、鼠顱骨成骨細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 目的探討Ti微粒對(duì)體外培養(yǎng)的新生大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響及淫羊藿甙注射液對(duì)其保護(hù)作用。方法取體外培養(yǎng)的新生大鼠成骨細(xì)胞，分別加入不同濃度的Ti微?；蛞蜣竭白⑸湟杭覶i微?；旌吓囵B(yǎng)，并于培養(yǎng)后24小時(shí)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)成骨細(xì)胞的凋亡情況，透射電鏡觀察成骨細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果Ti微?？烧T導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴性；用淫羊藿甙注射液處理3天后的成骨細(xì)胞可部分對(duì)抗Ti微粒致細(xì)胞損傷作用。結(jié)論Ti微

9、?？烧T導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，淫羊藿甙注射液對(duì)Ti微粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡具有部分保護(hù)作用。 第二部分淫羊藿甙對(duì)誘導(dǎo)假體松動(dòng)的骨吸收因子的影響 目的：觀察淫羊藿甙對(duì)關(guān)節(jié)磨屑刺激單核細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6、PGE2、TNF的影響。方法：分離培養(yǎng)兔外周血單核細(xì)胞，分成4組：D組：關(guān)節(jié)磨屑組，培養(yǎng)細(xì)胞中加入超高分子的聚乙烯顆粒(ultrahighmolecularweightpolyethylene,UHMWPE)。A組：D+10

10、mg/ml的淫羊藿甙。B組：D+1mg/ml的淫羊藿甙。C組：D+0.1mg/ml的淫羊藿甙。用放射免疫測(cè)定法測(cè)量各上清中PGE2及TNF含量。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定各上清中IL-1β及IL-6含量。結(jié)果：和D組比較，A、B、C三組各檢測(cè)指標(biāo)均明顯下降，且與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：淫羊藿甙可以降低假體周圍炎性細(xì)胞因子的含量，從而防治假體松動(dòng)的產(chǎn)生。 第三部分淫羊藿甙對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究淫羊藿甙

11、對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞功能的影響，探討淫羊藿甙促進(jìn)成骨的細(xì)胞及分子機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)分組將不同濃度的淫羊藿甙加入到其中進(jìn)行共培養(yǎng)，其對(duì)于成骨細(xì)胞增殖和分化的影響通過MTT比色實(shí)驗(yàn)、BGP含量的放免法檢測(cè)以及用熒光二抗的免疫組化實(shí)驗(yàn)測(cè)定Ⅰ型膠原酶的表達(dá)來進(jìn)行；對(duì)硝基苯磷酸鹽法及茜素紅染色法觀察淫羊藿甙對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的增殖、ALP表達(dá)的影響；用RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞的OPNmRNA表達(dá)，并進(jìn)行定量分析。結(jié)果：淫羊藿甙對(duì)成骨細(xì)胞

12、具有明顯的促增殖、分化及礦化作用；適當(dāng)濃度的淫羊藿甙可以增強(qiáng)OPNmRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：淫羊藿甙具有刺激體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的功能，它對(duì)成骨細(xì)胞中OPNmRNA和蛋白表達(dá)有明顯促進(jìn)作用。 第四部分淫羊藿甙對(duì)Ti微粒誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性假體松動(dòng)的影響 目的：觀察淫羊藿甙對(duì)模型兔假體松動(dòng)的防治作用，探討其防治機(jī)理。方法：將30只成年新西蘭兔隨機(jī)分成三組。分陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和用藥防治組，各10只，雌雄各半，手

13、術(shù)方法行模擬膝關(guān)節(jié)假體置換，6周后陽性對(duì)照組和用藥防治組向膝關(guān)節(jié)注射鈦微粒懸液，陰性對(duì)照組注射生理鹽水。用藥防治組隔日膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射淫羊藿甙注射液，其余兩組不與任何藥物自由飲水?dāng)z食。16周后處死動(dòng)物，取股骨下段作脫鈣切片，HE染色后光鏡下觀察假體周圍的病理變化；取膝關(guān)節(jié)囊研磨勻漿離心后測(cè)上清液中IL-1β和TNF含量。股骨及脛骨連同植入物取出后，在相同條件下(片距70CM，暴光時(shí)間5S)攝取X線正位照片，選用脛骨側(cè)攝片輸入計(jì)算機(jī)圖象分析系

14、統(tǒng)，定量分析脛骨側(cè)植入物周圍3mm厚度骨組織密度值[灰度值]，進(jìn)行比較。結(jié)果：和陰性對(duì)照組、用藥防治組比較，陽性對(duì)照組中檢測(cè)的IL-1β和TNF明顯增高，用藥防治組和陰性對(duì)比組比較無顯著差異。結(jié)論：淫羊藿甙可以降低假體周圍炎性細(xì)胞因子的含量，從而防治假體松動(dòng)的產(chǎn)生。 第五部分淫羊藿甙的制備工藝及質(zhì)量研究 目的：研究淫羊藿甙的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用大孔吸附樹脂柱層析分離和薄層色譜淫羊藿進(jìn)行定性鑒別，采用薄層掃描法測(cè)定