HPO-X的分離純化及分子生物學(xué)研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物肝臟具有強(qiáng)大的再生能力，一般情況下，人的肝臟在受損后3天之內(nèi)啟動(dòng)肝再生，2-3周后肝臟功能基本恢復(fù)，3-6個(gè)月后肝臟大小可恢復(fù)到與受損前一樣。而成年哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞大部分長(zhǎng)期處于G0期，只有當(dāng)肝臟在部分切除或受到損傷時(shí)，殘余肝細(xì)胞才能進(jìn)行快速的分裂，進(jìn)而使殘余肝組織代償性增生。因此，作為一種器官、組織再生的理想模型，肝臟損傷及其再生的分子生物學(xué)機(jī)制一直是人們研究的熱點(diǎn)課題之一。我國(guó)是一個(gè)肝病大國(guó)，病毒性肝炎、肝硬化與肝癌病人數(shù)在1

2、.2億左右，因而深入肝細(xì)胞損傷與再生的分子生物學(xué)機(jī)制研究，開(kāi)發(fā)治療肝損傷的藥物，具有十分重要的社會(huì)意義。 肝刺激物(hepaticstimulatorsubstance，HSS)是一種能特異啟動(dòng)并促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的活性物質(zhì)。近30年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞肝再生的機(jī)制，對(duì)動(dòng)物源及人源的HSS作了大量深入的研究，對(duì)其組織來(lái)源、理化性質(zhì)、分離純化、生物學(xué)性能以及應(yīng)用前景等都有了較深入的了解，但始終未能分離得到具有生物活性的HSS純品，無(wú)法確

3、定其分子結(jié)構(gòu)，對(duì)其作用機(jī)理的研究也還有待闡明。 我們實(shí)驗(yàn)室從上世紀(jì)80年代開(kāi)始致力于肝刺激物的分離純化研究，獲得了一種相對(duì)分子量在(10-30)×103Da之間，能特異刺激肝源細(xì)胞增殖，對(duì)CCl4引起的肝損傷具治療作用的細(xì)胞組分，命名為人肝細(xì)胞生成素(hepatopoietin，HPO)，并于1995年獲得美國(guó)專利。但由于其純度未能達(dá)到氨基酸序列測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)，所以始終未能獲得其氨基酸序列，從而不能確定其真正的身份。在本研究中，我們

4、采用DEAE-cellulose和Source15Q離子交換層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后割膠回收的方法從新生小牛肝臟中分離得到了三個(gè)具有體外促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)，經(jīng)多次富集后進(jìn)行Q-TOF質(zhì)譜測(cè)序，鑒定出其中之一是一個(gè)富亮氨酸的酸性核蛋白(Leucine-richacidicnuclearprotein，LANP)，其同源的人源體是pp32。pp32是一個(gè)多功能的酸性核蛋白，在正常組織可自我更新的細(xì)胞和腫瘤組織中都有較高水平的表達(dá)

5、。研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)以及形態(tài)發(fā)生等過(guò)程中都參與作用，但體外促進(jìn)肝細(xì)胞增殖方面目前沒(méi)有報(bào)道，因此我們也將次蛋白命名為HPO-X。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證其促增殖活性并對(duì)其作用機(jī)理作更加深入的研究，我們分別從人胎肝cDNA文庫(kù)和HL-60細(xì)胞中擴(kuò)增HPO-X和pp32基因，測(cè)序結(jié)果顯示HPO-X的核苷酸序列與pp32不完全一致，而與genebank中pp32的一個(gè)同源蛋白(序列號(hào)：XM496065)相同，

6、但pp32的N端和C段結(jié)構(gòu)域在HPO-X中依然存在。分別將HPO-X和pp32基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-24a(+)中，獲得重組pET-24a(+)-HPO-X和pET-24a(+)-pp32質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，并誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。獲得HPO-X和pp32的重組蛋白后，檢測(cè)其體外促進(jìn)肝源細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果表明重組HPO-X蛋白能夠明顯促進(jìn)SMMC7721肝癌細(xì)胞的增殖，使其DNA合成較對(duì)照提高近20倍。 為

7、驗(yàn)證HPO-X作為一種核蛋白在細(xì)胞中所起的作用，我們構(gòu)建HPO-X的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-HPO-X，將其轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞中表達(dá)，一方面觀察其亞細(xì)胞定位，另一方面觀察HPO-X在肝癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明EGFP-HPO-X融合蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)，但細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)，轉(zhuǎn)染pEGFP-HPO-X的SMMC7721細(xì)胞顯示出明顯生長(zhǎng)抑制。由此可以推斷HPO-X在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外有完全不同的生物學(xué)作用，可能與其作