神經祖細胞體外分化及脊髓移植的研究.pdf

1、脊髓損傷(spinalcordinjury，SCI)致使上、下行傳導束毀損，伴隨著神經元的損失，導致脊髓功能的永久喪失，恢復的希望非常有限。近年發(fā)現的神經干細胞(neuralstemcell，NSC)及神經祖細胞(neuralprogenitorcell，NPC)具有自我更新能力和多向分化潛能，為脊髓損傷的細胞替代治療提出了一條新的思路，已經成為脊髓損傷研究的活躍領域。 本文對兩種不同來源神經干細胞的體外分化特性進行了研究，并對

2、其脊髓移植后的轉歸進行了探索，以期為脊髓損傷的細胞替代治療研究提供有意義的實驗資料。 一.NG2陽性腦源性神經祖細胞(mBPCs)體外分化特性及同種異體脊髓移植研究 用形態(tài)學和電生理的方法證實其為神經膠質前體細胞，在體外能分化為有功能的神經元，移植后能與宿主脊髓組織良好整合并向神經元分化。 材料和方法 1.細胞來源：mBPCs來源于C57/BL6加強型綠色熒光蛋白轉基因小鼠，由Dr.Yong贈送。所有細胞

3、均表達綠色熒光蛋白，在熒光顯微鏡下呈現很強的綠色熒光。 2.細胞培養(yǎng)及分化：細胞種植于經多聚賴氨酸處理的玻片上，按培養(yǎng)條件不同分組。 3.免疫組化檢測：采用直接免疫熒光法檢測細胞的蛋白表型。一抗：鼠抗MAP-2，GFAP，synaptobrevin，兔抗NG2。二抗：結合了Alexa633的羊抗鼠和結合了Alexa546的羊抗兔IgG。 4.電生理特性檢測：采用全細胞電壓鉗技術檢測分化前后及不同培養(yǎng)條件下mBPC

4、s的電壓依賴型Na+和K+通道的變化，電壓鉗模式下記錄細胞膜離子通道電流和動作電位。 5.細胞移植：選用8-10周的同種(C57/BL6)雄性小鼠，采用微移植法將0.5μl(30，000/μl)mBPCs植入小鼠一側脊髓白質。 結果 1.mBPCs在生長培養(yǎng)基中生長時，大部分細胞表達少突膠質細胞特異性蛋白NG2，幾乎未見到MAP-2(神經元特異性蛋白)或GFAP(神經膠質細胞的特異性蛋白)陽性細胞。 2.

5、mBPCs在各組分化培養(yǎng)基生長10天后的免疫組化和電生理檢測結果相似：表達NG2的細胞數量有所減少；約有半數細胞表達MAP-2和SynaptobrevinⅡ；很少量細胞表達GFAP；可記錄到電壓依賴式K+電流和Na+電流。 3.與海馬神經元共培養(yǎng)30天后，98％的mBPCs表達MAP-2和SynaptobrevinⅡ，電壓依賴式K+電流和Na+電流的峰值強度明顯高于前述各組，并可記錄到動作電位。 4.移植后2周內，兩組動

6、物EGFP陽性細胞的蛋白表型及遷移模式相似：大部分為NG2陽性，未見MAP-2陽性細胞；細胞都局限于注射部位附近，未向遠處遷移。 5.移植后4-8周，兩組動物EGFP陽性細胞的蛋白表型及遷移模式表現出明顯差異：未分化注射組，約4.4％的EGFP陽性細胞為MAP-2陽性，大部分細胞局限于注射部位同側白質，少部分遷移到灰質及對側白質。 結論 1.在未分化狀態(tài)下的mBPCs表達少突膠質前體細胞特異性標記物NG2，不表達

7、成熟神經元特異性蛋白MAP-2和膠質細胞特異性蛋白GFAP，具有AMPA受體但缺乏谷氨酸轉運蛋白，是少突膠質祖細胞。 2.mBPCs在沒有有絲分裂原EGF和bFGF時，能向神經元方向分化，表達神經元的蛋白表型，雖然也具有K+Na+離子通道，但卻不能產生動作電位，說明這些細胞還不具備成熟神經元的電生理特征，不是具有功能意義的神經元。 3.BDNF和GDNF在體外沒有明顯促進mBPCs向神經元分化的作用。 4.與海馬

8、神經元共同培養(yǎng)能促進mBPCs分化為具有功能的成熟神經元，說明其雖然是其雖然是少突膠質祖細胞，卻具有多能神經干細胞的內在特性。 5.mBPCs向成熟神經元的分化需要復雜的因素。 6.mBPCs同種異體脊髓移植后能存活并與脊髓組織良好整合。 7.脊髓的內部環(huán)境抑制mBPCs向神經元的分化。 8.移植前mBPCs所處的分化階段對其移植后的轉歸有重要影響，體外預先對mBPCs進行定向誘導，能幫助mBPCs克服環(huán)

9、境因素的影響而向神經元方向分化。 二.永生化的人脊髓源性神經祖細胞(HSP1)大鼠脊髓移植的研究 HSP1細胞具有來源優(yōu)勢，在體外經誘導能分化為運動神經元樣細胞。但至今尚未見到體內移植的報道。本研究對其大鼠脊髓移植后的轉歸及其可能的機制進行了探討。 材料和方法 1.細胞來源：HSP1細胞由美國國立衛(wèi)生院的MehendraS.Rao教授提供，來源于3個月人胚脊髓，在體外通過逆轉錄病毒載體將編碼癌基因蛋白的基

10、因V-myc轉導入細胞中使之永生化。 2.細胞擴增與分化 擴增培養(yǎng)基組成：DMEM/F12，N2，B27，bFGF，EGF，IGF-Ⅱ，PDGF，BSA。HSP1細胞呈貼壁生長。 分化培養(yǎng)基組成：DMEM/F12，N2，CNTF，NGF，BDNF，CEE，NaturalMouseLaminin，doxycycline。 3.強力霉素有效濃度檢測：在分化培養(yǎng)基中分別給予1x0-20到20μg/ml不同濃度的

11、強力霉素，檢測細胞的形態(tài)和蛋白表型變化。 4.營養(yǎng)因子作用檢測：細胞分為兩組，培養(yǎng)基中強力霉素的濃度均為1μg/ml。檢測細胞的存活率。 實驗組：分化培養(yǎng)基中不加BDNF，NGF和CNTF。對照組：正常分化培養(yǎng)基。 5.免疫組化檢測：采用直接免疫熒光法檢測細胞的蛋白表型。 6.細胞移植：選用220-250克SD大鼠，采用微移植法將1μl(50，000/μl)HSP1細胞分別植入右側C4-5脊髓白質及右側海

12、馬。所有動物從術前3天開始給予免疫抑制劑cyclosporinA直到處死。術后當天開始服用強力霉素至2天，1周或2周。 低劑量強力霉素組：飲用水中強力霉素的濃度為20μg/ml，脊髓和海馬移植，術后1，2，3，4，6和8周處死動物。 無強力霉素組：飲用水中無強力霉素，脊髓和海馬移植，術后1，2，3，4，6和8周處死動物。 結果1.HSP1的表型特征：未分化HSP1胞體呈多邊型，突起多而短，hN+，hM+，nest

13、in+，NF+，Ki-67+，TUJi+，GFAP-；分化的HSP1胞體變小，呈圓形或梭形，突起長而細，hN+，hM+，nestin-,NF+，Ki-67-，TUJ1+，GFAP-，MAP-2+，Islet-1+。 2.強力霉素的有效誘導濃度：20μg/ml濃度組的細胞第二天全部死亡；10μg/ml濃度組的細胞第三天中只有1％的細胞存活；而在1x10-8到5μg/ml濃度范圍內細胞均能存活長達30天，細胞的形態(tài)和蛋白表型均呈現相

14、同的變化。 3.神經營養(yǎng)因子對細胞存活的影響：兩組細胞在第二天都開始出現形態(tài)變化，但細胞的存活率隨時間延長出現很大差異同，第三，第四，第五天兩組細胞的存活率分別為：實驗組28.6±6.5，14.1±7.2，1.8±5.2；對照組83.3±8.5，81.5±6.2，75.2±3.8。 4.移植HSP1細胞的脊髓內存活： 高劑量強力霉素組：移植2天和1周時脊髓內可見到大量hN+或hM+細胞，2周時細胞數量急劇減少，6

15、周及更長時間后幾乎見不到hN+或hM+細胞。 低劑量強力霉素組：在1，2和3周動物的脊髓和海馬中均?？梢姷酱罅康膆N+或hM+細胞，存活細胞的數量海馬遠比脊髓多，在存活更長時間的動物脊髓和海馬內幾乎都見不到hN+或hM+細胞。 無強力霉素組：在存活短于4周的動物脊髓和海馬中可見到大量hN+或hM+細胞，并形成邊界清楚的細胞團塊。6周后的動物均未見到hN+或hM+細胞。 5.移植HSP1細胞的分化： 低劑量

16、強力霉素組：hN+或hM+細胞突起短，Ki-67+，TUJ1+，nestin+，NF+。 高劑量強力霉素組：hN+或hM+細胞突起很長，與脊髓白質中的傳導束走行一致，Ki-67-，TUJ1+，nestin+。兩組均未見到MAP-2，Islet-1陽性細胞。 6.移植HSP1細胞的死亡原因：4周時，移植細胞內見到大量胞核碎片和ED1+細胞，可見ED1細胞吞噬現象，并有大量NK+細胞圍繞在移植物周圍，但正常細胞脊髓和海馬組織

17、未見類似現象。約11.9％的移植細胞為caspase-3陽性，10.8％為caspase-9陽性。移 結論 1.HSP1細胞能在體外誘導分化為具有神經元形態(tài)和蛋白表型的神經元樣細胞，并表達運動神經元標記物。 2.強力霉素的有效濃度范圍是1x10-8到5μg/ml，濃度高于10μg/ml時對細胞有毒性作用。 3.體外分化的HSP1細胞的存活依賴神經營養(yǎng)因子BDNF，NGF和CNTF的存在。 4.HS