rhTWEAK在乳腺癌中對(duì)TRAF1誘導(dǎo)作用的體外研究.pdf

1、腫瘤壞死因子樣微弱誘導(dǎo)劑(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)，作為TNF配體家族成員之一，為Ⅱ型跨膜蛋白，主要與細(xì)胞表面的TNF受體家族成員-Fn14(fibroblast growth factor inducible14)結(jié)合形成信號(hào)復(fù)合物來(lái)發(fā)揮廣泛的生物學(xué)活性，如：介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞的分化、移行和粘附，還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成。而目前發(fā)現(xiàn)的7種腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(Tu

2、mor necrosis factor receptor-associated factors，TRAFs)家族成員(TRAF1-7)，作為一類重要的細(xì)胞銜接蛋白，能夠與多種細(xì)胞表面受體的胞漿部分結(jié)合，參與多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，包括NF-κB和JNK通路。這7種成員盡管都含有TRAF同源結(jié)構(gòu)域，但是在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中所起到的作用卻不盡相同，其中以TRAF1最為特殊，因其不僅在正常組織中表達(dá)局限，而且是TRAFs家族中唯一不含有TR

3、AFN端環(huán)指結(jié)構(gòu)域的成員。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于TRAF1在信號(hào)通路中的作用及其作用方式存在不同看法：有些研究認(rèn)為TRAF1在TNFR家族誘導(dǎo)的NF-κB活化中作為負(fù)性調(diào)控子存在；另外一些研究則表明，在細(xì)胞系中外源性轉(zhuǎn)染TRAF1使之過(guò)表達(dá)可促進(jìn)NF-κB活化。而且關(guān)于乳腺癌中TRAF1在TWEAK誘導(dǎo)的NF-kB活化中的作用研究，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)主要利用免疫熒光檢測(cè)幾種不同乳腺癌細(xì)胞系中Fn14的表達(dá)情況，利用Weste

4、rn Blot和免疫共沉淀檢測(cè)在rhTWEAK(重組人TWEAK)刺激下幾種乳腺癌細(xì)胞系中TRAF1表達(dá)改變的情況，以及經(jīng)過(guò)rhTWEAK刺激之后是否發(fā)生了NF-κB信號(hào)通路的活化。 材料與方法： 一、材料 正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，人雌激素受體非依賴性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s。 二、主要試劑和來(lái)源 羊抗人多克隆anti-Fn14抗體(sc-27141)、鼠

5、抗人單克隆anti-TRAF1抗體(sc-6253)鼠抗人單克隆anti-TRAF2抗體(sc-7346)均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。鼠抗人單克隆anti-Phospho-IkBα抗體(＃9246)購(gòu)自Cell signaling公司。人重組TWEAK(rhTWEAK)(＃310-06)購(gòu)自Peprotech公司。DAB酶底物顯色試劑盒(ZLI-9032)和辣根酶標(biāo)記第二抗體(ZB-2301)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免

6、疫共沉淀相關(guān)μColumns(Order No.130-042-701)和μMACS Protein GMicroBeads(Order No.130-071-101)購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司。DMEM高糖、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司。胰酶(Order No.27250018)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Western blot及IP細(xì)胞裂解液(Order No.P0013)購(gòu)自碧云天生物

7、技術(shù)研究所。 三、方法 1、應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)Fn14在培養(yǎng)的正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中的表達(dá)。 2、應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)經(jīng)rhTwEAK刺激之后，培養(yǎng)的正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中TRAF1表達(dá)改變的情況。 3、應(yīng)用免疫共沉淀方法檢測(cè)經(jīng)rhTWEAK刺激之后

8、，培養(yǎng)的正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中與TRAF2呈結(jié)合狀態(tài)的TRAF1表達(dá)改變的情況。 4、應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)經(jīng)rhTWEAK刺激之后，培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中NF-kB信號(hào)通路的活化情況。 5、應(yīng)用SPSSl2.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)TRAF1在各細(xì)胞系中的表達(dá)量以及TRAF1與TRAF2在各細(xì)胞系中的

9、結(jié)合量進(jìn)行方差分析及其兩兩檢驗(yàn)，p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、免疫熒光方法檢測(cè)Fn14在正常乳腺上皮細(xì)胞系及乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá) (1)在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中Fn14陽(yáng)性表達(dá)。 (2)在正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435s中未觀察到Fn14的表達(dá)。 2、Western blot方法檢測(cè) 經(jīng)rhTWEA

10、K刺激后TRAF1在正常乳腺上皮細(xì)胞系及乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá) (1)以不同濃度的rhTWEAK與三株細(xì)胞系分別孵育24h后收集細(xì)胞，經(jīng)Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)n14陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞系MDA-MB-231中TRAF1呈濃度依賴性表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，而Fn14陰性表達(dá)的細(xì)胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中TRAF1則呈濃度依賴性表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。 (2)以100ng/ml的rhTWEAK同三

11、株細(xì)胞系分別孵育，按照設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，經(jīng)Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)n14陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞系MDA-MB-231中TRAF1呈時(shí)間依賴性表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，而Fn14陰性表達(dá)的細(xì)胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中TRAF1則呈時(shí)間依賴性表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。 3、免疫共沉淀檢測(cè) 經(jīng)rhTWEAK刺激后TRAF1和TRAF2在正常乳腺上皮細(xì)胞系及乳腺癌細(xì)胞系中的結(jié)合情況 (1)TRA

12、F1與TRAF2在MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-435s三種細(xì)胞系中均結(jié)合。 (2)以100ng/ml的rhTWEAK同三株細(xì)胞系分別孵育24h后收集細(xì)胞，與TRAF2呈結(jié)合狀態(tài)的TRAF1在Fn14陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞系MDA-MB-231中表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，而在Fn14陰性表達(dá)的細(xì)胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。 4、Western blot方法檢測(cè)

13、 經(jīng)rhTWEAK刺激后乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中NF-kB信號(hào)通路的活化情況 (1)在MDA-MB-231中，經(jīng)rhTWEAK刺激之后出現(xiàn)了短暫(15-30min)的I-kBα的磷酸化。 (2)在MDA-MB-435s中則沒(méi)有觀察到一過(guò)性的I-kBα的磷酸化。 結(jié)論： 1、Fn14在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中陽(yáng)性表達(dá)，在正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A和乳腺

14、癌細(xì)胞系MDA-MB-435s中不表達(dá)。 2、rhTWEAK對(duì)TRAF1的誘導(dǎo)作用表現(xiàn)為在Fn14陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞系MDA-MB-231中呈濃度和時(shí)間依賴性上調(diào)，而在Fn14陰性表達(dá)的細(xì)胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中呈濃度和時(shí)間依賴性下調(diào)。 3、rhTWEAK可以誘導(dǎo)Fn14陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞系MDA-MB-231中NF-kB信號(hào)通路的活化。 以上結(jié)論提示在乳腺癌細(xì)胞系中，rhTWEAK對(duì)TRAF1的誘導(dǎo)