人工細(xì)胞外支架：50μm細(xì)絲鈦網(wǎng)三維結(jié)構(gòu)對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨質(zhì)缺損仍是目前導(dǎo)致患者功能喪失及生活質(zhì)量降低的重要問(wèn)題。臨床上最為常用的修復(fù)方法仍是自體骨移植，然而這種方法卻存在著一定的弊端。尋求更為合適的骨缺損修復(fù)方法成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)，這就需要多學(xué)科的共同努力。組織工程的興起為骨缺損的修復(fù)提供了一條廣闊的途徑。上世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)了具有多項(xiàng)分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，使其成為理想的骨組織工程種子細(xì)胞，同時(shí)支架材料的研究也逐漸從二維結(jié)構(gòu)向三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。
　　本實(shí)驗(yàn)提出了具有三維結(jié)構(gòu)特性的鈦網(wǎng)(T

2、itanium web，TW)，擬通過(guò)體外成功培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，觀察鈦網(wǎng)對(duì)兔骨髓MSCs的成骨作用。以便了解該材料作為骨組織工程支架材料的特性。
　　材料和方法:
　　1.本實(shí)驗(yàn)所采用的三維鈦網(wǎng)是由日本Kuboki教授設(shè)計(jì)、HI-LEX公司提供的。材料特性為20-100μm直徑的鈦纖維束編織而成，內(nèi)部形狀為類蜂巢狀結(jié)構(gòu)，孔的平均直徑為50-250μm，孔隙率達(dá)6

3、0-87％(圖1)。選取普通級(jí)新西蘭大白兔，4～6周齡。采用20％烏拉坦按以5 ml/kg體重的劑量麻醉新西蘭大白兔，無(wú)菌條件下取出大白兔的股骨，并移入超凈工作臺(tái)。沿股骨干中間剪開，將髓腔內(nèi)容物反復(fù)沖出。采用密度梯度離心與全骨髓貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從骨髓(Bone marrow, BM)中分離出來(lái)。
　　2.兔骨髓MSCs的鑒定:倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)，選取生長(zhǎng)特性穩(wěn)定的第三代細(xì)胞，待其達(dá)80％融合時(shí)，

4、分別換用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基。2周后通過(guò)堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)染色、茜素紅染色及油紅O染色鑒定細(xì)胞是否已發(fā)生定向分化。判斷體外培養(yǎng)的細(xì)胞是否為兔骨髓MSCs。
　　3.將已成功獲得的兔骨髓MSCs與細(xì)絲鈦網(wǎng)共同培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞能否順利生長(zhǎng)在鈦網(wǎng)上。
　　4.由于鈦網(wǎng)的不透光性，倒置顯微鏡并不能準(zhǔn)確觀察細(xì)胞在鈦網(wǎng)上的生長(zhǎng)特點(diǎn)，故采用掃描電鏡(Scanning elec

5、tron microscope，SEM)來(lái)觀察其生長(zhǎng)特點(diǎn)。
　　5.鈦網(wǎng)與兔骨髓MSCs共同培養(yǎng)后，取出鈦網(wǎng)，采用ALP染色觀察分析鈦網(wǎng)周圍與其有接觸的兔骨髓MSCs的成骨特性。
　　結(jié)果:
　　1.原代兔骨髓MSCs培養(yǎng)早期可見少數(shù)單個(gè)核細(xì)胞貼壁，形態(tài)細(xì)胞呈多角形。6-10d后細(xì)胞增殖速度加快并且發(fā)生細(xì)胞間的融合，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形，且細(xì)胞形態(tài)逐漸均一，融合后表現(xiàn)為魚肉狀。
　　2.對(duì)原代培養(yǎng)的

6、兔骨髓MSCs進(jìn)行成骨及成脂誘導(dǎo)，對(duì)于成骨誘導(dǎo)組2周后行茜素紅染色及ALP染色，可見胞漿中有礦化結(jié)節(jié)及較多的棕紅色顆粒。對(duì)于成脂誘導(dǎo)組，顯微鏡下觀察細(xì)胞體積變大，核周可見空泡樣結(jié)構(gòu)。進(jìn)行油紅O染色，可見細(xì)胞內(nèi)有紅色脂滴，有的融合成大脂滴，有的成串珠樣排列。
　　3.將鈦網(wǎng)與兔骨髓MSCs共同培養(yǎng)后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞及鈦網(wǎng)的關(guān)系時(shí)，由于鈦網(wǎng)的不透光性，偶可見鈦網(wǎng)支架邊上有細(xì)胞生長(zhǎng)。通過(guò)SEM，可以觀察到兔骨髓MSCs能良好的生長(zhǎng)

7、在鈦網(wǎng)上，細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)1周后，細(xì)胞已在材料表面和孔隙內(nèi)均可黏附和生長(zhǎng)，但數(shù)量較少;隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)、分化和增殖。2周后大量細(xì)胞粘附在鈦網(wǎng)上，細(xì)胞數(shù)量明顯多于1周時(shí)，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間相互交錯(cuò)生長(zhǎng)，呈網(wǎng)狀覆蓋材料的表面，同時(shí)可見細(xì)胞分泌的基質(zhì)也沉積于細(xì)胞周圍及支架表面。
　　4.鈦網(wǎng)與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)2周后，取出鈦網(wǎng)，將位于孔板底部的細(xì)胞進(jìn)行ALP染色，見與鈦網(wǎng)接觸想細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多的棕紅色顆粒