妊娠期正己烷暴露后子代卵巢發(fā)育及其細(xì)胞DNA甲基化模式研究.pdf

1、正己烷是一種廣泛用于食品、藥品和有機(jī)合成的溶劑。因其常溫下易揮發(fā)職業(yè)暴露多通過呼吸道途徑,暴露人群中育齡女性比例較高。正己烷早期被認(rèn)為低毒或微毒物而廣泛應(yīng)用于各行業(yè),但近年來的研究表明正己烷及其代謝產(chǎn)物對雌性生殖內(nèi)分泌有明顯的干擾,同時(shí)基礎(chǔ)毒理學(xué)資料表明妊娠期正己烷暴露有可能造成子代生長發(fā)育障礙,且正己烷無明顯的致DNA突變效應(yīng)。因此我們通過建立妊娠Wista大鼠正己烷暴露模型來研究妊娠期正己烷暴露對子代成年后卵巢生長發(fā)育、卵巢顆粒細(xì)胞

2、DNA甲基化狀態(tài)及卵巢顆粒細(xì)胞激素分泌功能的影響,明確胚胎發(fā)育期正己烷暴露對子代雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響,有利于進(jìn)一步提高對正己烷職業(yè)暴露的防控和危險(xiǎn)人群的干預(yù)。
　　目的:
　　通過建立Wista大鼠妊娠期正己烷暴露模型,研究妊娠期正己烷暴露對子代成年后卵巢生長發(fā)育、卵巢顆粒細(xì)胞DNA甲基化狀態(tài)及卵巢顆粒細(xì)胞激素分泌功能的影響,進(jìn)一步從機(jī)制上闡明妊娠期正己烷暴露對于子代卵巢發(fā)育和功能的影響。為正己烷卵巢發(fā)育毒性及機(jī)制研究提供

3、科學(xué)依據(jù)?；谝陨夏康?我們將研究分為以下三個(gè)部分:
　　(一)妊娠期正己烷暴露對F1代大鼠卵巢發(fā)育和激素分泌功能的影響
　　方法:
　　清潔級成年Wistar大鼠,雌性體重210-230g,雄性300-320g,合籠受孕后,每組5只。GD1-20分別暴露于0、100、500、2500和12500ppm正己烷,靜式吸入染毒,4h/d,F1代雌鼠PD56取卵巢。觀察大鼠的出生性別比、F1代雌鼠的體重增長、陰道開放時(shí)間和動

4、情周期;HE染色連續(xù)切片測量各級卵泡數(shù)并觀察卵巢病理改變;分離F1代雌鼠卵巢顆粒細(xì)胞,競爭性電化學(xué)發(fā)光法測定F1代雌鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液雌二醇和孕酮水平。
　　結(jié)果:
　　(1)出生活胎數(shù)和性別比:12500ppm組的出生活胎數(shù)顯著低于其他各組(p<0.05);隨著暴露劑量的增加,雌/雄性別比有下降的趨勢。
　　(2)體重增長和陰道開放時(shí)間:各正己烷暴露組體重和對照組總體上無顯著性差異(p>0.05),但d36日之后有

5、增長減緩的趨勢;正己烷暴露組陰道開放時(shí)間與對照組比較無顯著差異(p>0.05)。
　　(3)動情周期:與對照組比較,100,500和2500ppm組的動情前期顯著延長(p<0.05),500ppm和2500ppm組動情期顯著延長(p<0.05),12500ppm組動情間期顯著縮短(p<0.05)。
　　(4)卵泡數(shù)目構(gòu)成比:12500ppm組的次級卵泡比例顯著低于對照組(p<0.05),閉鎖卵泡比例顯著高于對照組(p<0.0

6、5)。
　　(5)卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液雌二醇、孕酮水平:2500和12500ppm雌二醇分泌水平顯著低于對照組(p<0.05);100和500ppm組孕酮分泌水平顯著高于對照組,而12500ppm組孕酮分泌水平顯著低于對照組(p<0.05)。
　　(二)妊娠期正己烷暴露對F1代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞啟動子區(qū)差異甲基化全基因組研究
　　方法:
　　分離F1代大鼠的卵巢顆粒細(xì)胞,DNeasyBlood&TissueKit提取

7、基因組DNA,超聲破碎后與5-mC抗體免疫共沉淀,再與Nimblegen385KPromoterPlusCpGIslandArrays雜交,以啟動子區(qū)探針PeakScore>2并和對照組有差別為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異甲基化基因。將差異甲基化基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行以下分析:GeneOntologyConsortium方法注釋差異性甲基化基因、差異性甲基化基因DAVID聚類分析、DAVID聚類基因Pmvalue值二項(xiàng)聚類分析組間甲基化模式差異、

8、差異甲基化基因KEGG信號通路分析。
　　結(jié)果:
　　(1)基因組DNA無明顯的降解并裂解充分,甲基化免疫沉淀特異性高,甲基化芯片信號清楚,陽性對照信號清晰。
　　(2)正己烷暴露組共同基因中,去甲基化基因多于高甲基化基因。
　　(3)基因注釋表明正己烷的效應(yīng)主要與細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞內(nèi)基因和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性基因有關(guān)。
　　(4)細(xì)胞死亡、細(xì)胞生長和激素調(diào)控三個(gè)DAVID聚類結(jié)果pm值分析結(jié)果表明,對照和

9、500ppm組的甲基化模式比較接近,2500和12500ppm組的甲基化模式相對接近。
　　(5)KEGG信號通路分析結(jié)果的表明:凋亡通路中12500ppm組促凋亡基因Bad啟動子區(qū)低甲基化,500ppm組凋亡促進(jìn)基因NFKBIA,Bid,Casp7,Dffb啟動子區(qū)高甲基化。在激素合成通路,2500和12500ppm組Cyp11a1,Cyp17a1,Hsd3b1和Srd5a1基因啟動子區(qū)的高甲基化。
　　(三)妊娠期正己烷

10、暴露對F1代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞激素分泌相關(guān)基因啟動子甲基化研究
　　方法:
　　測定MeDIP-Chip芯片譜中激素合成基因相關(guān)基因啟動子區(qū)差異甲基化峰及探針位點(diǎn),MS-HRM法驗(yàn)證篩選出激素合成相關(guān)基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),RealtimePCR法測定篩選基因的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　(1)激素合成基因相關(guān)基因啟動子區(qū)差異甲基化峰測量:Star基因,500ppm組的甲基化程度低于對照組,而12500pp

11、m組明顯高于對照組(p<0.05);Cyp11a1基因,2500ppm和12500ppm組的甲基化程度明顯高于對照組(p<0.05);Cyp17a1基因,2500ppm和12500ppm組的甲基化程度明顯高于對照組(p<0.05);Hsd3b基因,12500ppm組的甲基化程度顯著高于對照組(p<0.05)。
　　(2)MS-HRM驗(yàn)證甲基化程度:Star基因啟動子局部區(qū)域甲基化程度從高到低排列為:12500ppm>2500ppm

12、>control>500ppm>100ppm;Cyp11a1基因啟動子局部區(qū)域甲基化程度從高到低排列為:12500ppm>2500ppm>control>500ppm和100ppm;Cyp17a1啟動子局部區(qū)域甲基化程度從高到低排列為:12500ppm和2500ppm>control>500ppm和100ppm;Hsd3b啟動子局部區(qū)域基因甲基化程度從高到低排列為:12500ppm>2500ppm和Control>100ppm和500p

13、pm。
　　(3)RT-PCR結(jié)果:Star、Cyp11a1、Cyp17a1和Hsd3bmRNA表達(dá)量與對照組比較出現(xiàn)了明顯改變,具體如下:與對照組比較,Star基因,500ppm組表達(dá)量顯著增高(p<0.05),12500ppm組表達(dá)量顯著下降(p<0.05);Cyp11a1基因,500ppm組表達(dá)量顯著增高(p<0.05),12500ppm表達(dá)量顯著下降(p<0.05);Cyp17a1基因,500ppm組顯著增高(p<0.05

14、),2500ppm和12500ppm顯著下降(p<0.05);Hsd3b基因,12500ppm組顯著下降(p<0.05)。
　　結(jié)論:
　　根據(jù)以上結(jié)果,可得出如下結(jié)論
　　1.妊娠期高濃度正己烷暴露具有明顯的胚胎毒性,并能影響F1代雌性大鼠的卵巢發(fā)育和激素分泌功能。
　　2.妊娠期正己烷暴露會改變子代卵巢顆粒細(xì)胞的DNA啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),高劑量的正己烷暴露(2500和12500ppm)能明顯改變顆粒細(xì)胞凋亡基