電壓門控鉀通道和線粒體膜上ATP敏感鉀通道在人體缺氧性肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用及調(diào)控機制的研究.pdf

1、研究背景:目前，肺動脈高壓和肺心病的發(fā)病率仍然居高不下。缺氧性肺動脈高壓(hypoxicpulmonaryhypertension，HPH)是最常見的類型，其發(fā)病機制目前尚不十分清楚，缺氧性肺血管收縮(hypoxicpulmonaryarteryvasoconstriction，HPV)和缺氧性肺血管重建(hypoxicpulmonaryvascularremodeling)是其兩大病理生理基礎(chǔ)。目前認為，缺氧引起的肺血管收縮并非完全依

2、賴于血管內(nèi)皮細胞，血管平滑肌細胞也可介導(dǎo)血管收縮反應(yīng)。在影響血管張力的各種因素中，血管平滑肌細胞鉀通道發(fā)揮著十分重要的作用。鉀通道可能與肺血管收縮和重建都有密切的聯(lián)系，因此，研究者將缺氧與鉀通道的關(guān)系作為研究熱點，但目前以人體肺動脈平滑肌細胞為研究對象的還比較少。 缺氧可抑制肺動脈平滑肌細胞鉀通道的活性，引起肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)去極化，達到一定閾值后，電壓依賴性鈣通道開放，引起細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，作為重要的第二信使

3、，鈣離子促發(fā)肺動脈平滑肌細胞收縮、增殖和遷移，也可激活各種蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，進一步引起缺氧性肺血管收縮和肺血管重建，最終導(dǎo)致肺動脈高壓。肺動脈平滑肌細胞已知有三種鉀通道，分別是延遲整流鉀通道(Kv)、鈣激活的鉀通道(Kca)和ATP敏感的鉀通道(KATP)。目前的研究表明，Kv在控制靜息膜電位及氧感受方面起著重要的作用。 在缺氧性肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展中，缺氧介導(dǎo)肺血管舒縮障礙的各種體液因子以及介導(dǎo)肺血管重建的各種細胞增殖因子形

4、成了復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，這些網(wǎng)絡(luò)之間的調(diào)控機制是怎樣的，他們又是如何對鉀通道進行調(diào)控的，對平滑肌細胞增殖和凋亡又是怎樣調(diào)控的，關(guān)于這些的研究還不多，以人體肺動脈平滑肌細胞為研究對象的更少。線粒體膜上ATP敏感的鉀通道(MitoKATP)是影響線粒體膜電位(△ψm)的重要因素，目前它在心肌細胞缺氧和缺血預(yù)適應(yīng)中研究的比較多，在其它方面，尤其是肺疾病方面研究的甚少。MitoKATP同樣是對缺氧非常敏感，MitoKATP在有氧的情況下通常是關(guān)

5、閉的，此時△ψm處于垮塌狀態(tài)；反之MitoKATP被激活而開放，△ψm去極化。線粒體、MitoKATP和Kv通道都是敏感的氧感受器，MitoKATP與Kv是否相互聯(lián)系呢?與PASMCs的增殖是否有聯(lián)系呢?另外PKC、鈣離子和Bcl-2等在其中又起什么作用呢?基于此，本研究從離子通道水平和基因表達水平，利用分子生物學(xué)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、膜片鉗技術(shù)，激光共聚焦顯微技術(shù)等多種實驗方法，探討Kv和MitoKATP在肺血管重建中的作用及其調(diào)控機制

6、，為HPH的發(fā)病機制研究和防治提供基礎(chǔ)資料。 第一部分線粒體膜上ATP敏感鉀通道在缺氧抑制人體肺動脈平滑肌細胞膜上電壓門控鉀通道中的作用 目的：線粒體膜上ATP敏感鉀通道(MitoKATP)在細胞缺氧信號傳導(dǎo)中的作用已經(jīng)開始被重視，它是影響線粒體膜電位(△ψm)的重要因素，MitoKATP開放引起△ψm去極化。本實驗從MitoKATP入手，研究它在缺氧影響人體肺動脈平滑肌細胞膜電位及鉀通道Kv1.5基因表達中的作用，旨在

7、探索人類肺動脈高壓、肺源性心臟病的發(fā)生機制，為找到新的防治方法的探索提供試驗依據(jù)。 方法：(略） 結(jié)果：(略） 結(jié)論：本實驗結(jié)果顯示，缺氧可以引起MitoKATP的開放以及△ψm的去極化，并進而抑制了Kv的功能，參與并影響了肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展。至于缺氧是怎樣引起MitoKATP開放的以及MitoKATP的開放又是如何影響Kv通道的，他們之間的信號傳導(dǎo)途徑還要在后續(xù)的實驗中進一步研究。 第二部分PKC在

8、線粒體膜上ATP敏感鉀通道影響人體肺動脈平滑肌細胞膜電位和Kv1.5基因表達中的作用 目的：肺動脈高壓和肺心病，目前其仍有較高的發(fā)病率。PKC信號傳導(dǎo)通路在肺動脈高壓中發(fā)揮重要作用。Kv通道在調(diào)節(jié)細胞膜電位上是最重要的，它是目前肺動脈高壓發(fā)病機制研究的一個熱點，但精確機制仍不清楚。Kv通道的表達和活性被許多因素調(diào)控，例如第二信使(cAMP,cGMP)和蛋白激酶。所有能影響Kv通道的因素都可引起血管收縮或舒張。近來，線粒體膜電位(

9、△ψm)在細胞缺氧信號傳導(dǎo)中的作用已經(jīng)開始被重視，線粒體膜上ATP敏感鉀通道(MitoKATP)是影響△ψm的重要因素，MitoKATP開放引起△ψm去極化。MitoKATP是否也參與了肺動脈高壓的發(fā)生呢?MitoKATP與Kv是否相互聯(lián)系呢?本試驗以人體肺動脈平滑肌細胞為研究對象，利用分子生物學(xué)和膜片鉗技術(shù)，研究MitoKATP對人體PASMCs膜電位及Kv1.5表達的影響，及其PKC在其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的可能作用，旨在探索人類肺源性肺動脈

10、高壓心臟病的發(fā)生機制，為找到新的防治方法的探索提供試驗依據(jù)。 方法：(略） 結(jié)果：（略） 結(jié)論：本實驗結(jié)果顯示，MitoKATP的開放可抑制Kv通道的活性和表達，可能參與并影響了肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展，其中PKC在其中可能起介導(dǎo)作用，Diazoxide與R0-31-8220同時應(yīng)用沒有使Kv電流和Kv1.5的表達恢復(fù)到正常對照組水平，說明可能除了PKC以外還有其它的因素參與其中，有待進一步研究。 第三部分

11、線粒體膜上ATP敏感鉀通道在缺氧性人體肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用 目的：缺氧性肺動脈高壓(hypoxicpulmonaryhypertension，HPH)的發(fā)病機制目前尚不十分清楚，缺氧性肺血管收縮(hypoxicpulmonaryarteryvasoconstriction，HPV)和缺氧性肺血管重建(hypoxicpulmonaryvascularremodeling)是其兩大病理生理基礎(chǔ)。肺動脈平滑肌細胞增殖在肺血管重

12、建中起十分重要的作用，但是其中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還不清楚。線粒體膜上ATP敏感鉀通道(MitoKATP)對缺氧十分敏感，它是影響線粒體膜電位的重要因素。本實驗從線粒體膜上ATP敏感的鉀通道(mitochondrialmembraneATP-sensitivepotassiumchannel,MitoKAATP)入手，研究線粒體膜電位在缺氧性肺血管重建中的作用。 方法：(略） 結(jié)果：（略） 結(jié)論：本實驗結(jié)果顯示，Mit

13、oKATP是缺氧引起肺血管重建通路中的一個重要環(huán)節(jié)，MitoKATP可能參與并影響了肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展，至于它和缺氧之間的相互關(guān)系及其信號傳導(dǎo)途徑還要在后續(xù)的實驗中進一步研究。 第四部分Ca2+-MitoKATP通路在Kv通道的抑制介導(dǎo)人體肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用 目的：肺血管重建是肺動脈高壓的一個主要的病理特征。肺血管重建主要表現(xiàn)為肺動脈平滑肌細胞過度增殖，可能是由于增殖的促進和/或凋亡的抑制引起。但其中精確的

14、機制尚不清楚。目前，Kv通道在肺動脈高壓發(fā)生機制中的作用成為研究熱點，Kv通道可能介導(dǎo)了PASMCs的增殖，但在人體肺動脈平滑肌細胞模型上研究很少。本研究是以人體PASMCs為研究對象，探討Kv通道與肺血管重建的可能聯(lián)系，以及探討線粒體膜上ATP敏感的鉀通道(MitoKATP)、細胞內(nèi)鈣離子和Bcl-2等因素在Kv通道介導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用，旨在探索人類肺源性肺動脈高壓心臟病的發(fā)生機制，為找到新的防治方法的探索提供試驗依據(jù)。

15、 方法：分離出人正常肺動脈平滑肌細胞(humanpulmonaryarterysmoothmusclecells，HPASMCs)，進行常氧培養(yǎng)。分組情況：線粒體膜電位的檢測和細胞內(nèi)鈣離子濃度的檢測實驗分為3組：①正常對照組；②4-AP(Kv通道特異性阻斷劑)組；③4-AP+EGTA(細胞外鈣離子鰲合劑)組；細胞增殖凋亡的檢測實驗分為5組：①正常對照組；②4-AP組；③4-AP+Diazoxide組；④4-AP+5-HD組；⑤4-

16、AP+EGTA。利用四甲基偶氮唑藍(MTT)、原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)、增殖細胞核抗原(PCNA)、Fura-2熒光測定細胞內(nèi)鈣離子濃度、免疫組化方法檢測肺動脈平滑肌細胞Bcl-2的蛋白表達等方法分析PASMCs增殖凋亡情況；線粒體膜電位的檢測采用Rhodamine-123fluorescence法。 結(jié)果：（略） 結(jié)論：本實驗結(jié)果顯示，Kv通道的抑制可以介導(dǎo)人體肺動脈平滑肌細胞的增殖；并且Kv通道的抑制還可以使M