乙肝病毒核心抗原病毒樣顆粒負(fù)載的樹突狀細(xì)胞抗原提呈能力的研究.pdf

1、目的：樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)作為目前發(fā)現(xiàn)的抗原提呈能力最強的專職抗原提呈細(xì)胞，控制著免疫應(yīng)答的性質(zhì)、強度和免疫記憶性。隨著DC體外培養(yǎng)技術(shù)的建立，已有多項研究表明，體外培養(yǎng)的不成熟DC可高效攝取病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)，不僅可誘導(dǎo)體液免疫的發(fā)生，而且可通過交叉抗原提呈途徑，激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。在此過程中，VLPs除作為抗原表達(dá)載體為DC提供了特異性抗原外，還可刺激DC成熟

2、，誘導(dǎo)DC的MHC-I和II類分子及一些黏附分子的表達(dá)。因此，用VLPs負(fù)載DC，構(gòu)建DC疫苗，為腫瘤和胞內(nèi)感染病原疫苗的研制開辟了新的途徑。 乙肝病毒核心抗原(Hepatitis B core，HBc)是乙肝病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，在細(xì)菌、酵母菌及哺乳動物細(xì)胞內(nèi)均能高效表達(dá)、自動裝配成球形顆粒，并可插入外源短肽，同時保持外源肽或表位正確構(gòu)象，有較強免疫原性。因此，用HBc-VLPs負(fù)載DC，可能是DC疫苗研究的較好模型。

3、隨人類基因組計劃實施和推進，生命科學(xué)研究進入后基因組時代，新的學(xué)科-蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)誕生。蛋白質(zhì)組學(xué)可剛來研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動態(tài)變化規(guī)律，能從更深一層次認(rèn)識生命活動的規(guī)律。 基于上述原因，在本研究中，我們在原核系統(tǒng)表達(dá)了乙肝核心蛋白，以其組裝成的乙肝核心蛋白病毒樣顆粒(HBc-VLPs)為模型，首次采用能獲得高通量信息的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究DC攝取HBc-VLPs后細(xì)胞整體蛋白譜的改變，通過基質(zhì)輔助激光解析

4、電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assistedlaser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS)鑒定得到了有意義的蛋白質(zhì)，為研究DC細(xì)胞活化和DC疫苗的免疫機制提供了新的線索和思路。 方法：(1)乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的制備：擴增pET28a-HBc的工程菌，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，包涵體形式表達(dá)的HBc蛋白的變性、Ni-NTA親和

5、層析純化和復(fù)性。(2)HBc-VLPs的鑒定：通過SDS-PAGE電泳、蛋白免疫印跡實驗檢測HBc蛋白的表達(dá)和免疫原性，透射電鏡觀察HBc蛋白VLPs的形成。(3)小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)：樹突狀細(xì)胞由小鼠骨髓獲得經(jīng)細(xì)胞因子rmlL-4和rmGM-CSF誘導(dǎo)分化成為未成熟BMDC。(4)BMDC對HBc-VLPs的吞噬：激光共聚焦顯微鏡觀察不同時間點小鼠BMDC對HBc-VLPs的吞噬。(5)流式細(xì)胞儀分析BMDC表面分子標(biāo)記：F

6、ITC標(biāo)記的抗小鼠CD11c抗體SDFITC標(biāo)記的抗小鼠CD86、CD80和MHC-II分子抗體表面染色后，流式細(xì)胞儀檢測。(6)細(xì)胞因子的mRNA水平測定：常規(guī)方法抽提不同處理組BMDC細(xì)胞的總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA片段。用合成的細(xì)胞因子(IFN-γ、TL-12)和內(nèi)參照(β-actin)的引物，擴增cDNA片段并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。(7)BMDC攝取HBc-VLPs前后細(xì)胞總體蛋白表達(dá)的差異及差異蛋白的質(zhì)譜分析：①攝

7、取HBc-VLPs前后BMDC細(xì)胞總蛋白的二維電泳：I蛋白樣品的準(zhǔn)備：提取細(xì)胞蛋白經(jīng)Clean-Up處理后，BCA法測定蛋白樣品濃度。II二維電泳：一向：等電聚焦，每根IPG上樣150μg，經(jīng)30伏持續(xù)低電壓水化、200伏，1小時除鹽后，梯度升壓、穩(wěn)壓至8000伏，持續(xù)6-8小時，保證總量為50000伏特小時；二向：聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：灌制板膠、將膠條平衡處理后轉(zhuǎn)移至膠板、20 mA/gel垂直電泳5-6小時。Ⅲ硝酸

8、銀染色：固定、敏化、漂洗、硝酸銀染色、漂洗、顯色、終止、漂洗、1％乙酸中保存。②蛋白點分析與選取：凝膠通過ChemiIanlgeTM 5500成像系統(tǒng)獲得數(shù)字化的圖像。使用計算機應(yīng)用圖像軟件IamgerMasterTM 5.0對圖像進行分析，選取明顯差異的蛋白點(3倍或以上差異)。③基質(zhì)輔助激光解析離子化-飛行時間質(zhì)譜質(zhì)譜鑒定選取蛋白并在UniProt和NCBInr數(shù)據(jù)庫中進行肽質(zhì)量搜索，明確它們可能是何種蛋白。(8)根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果對

9、膜聯(lián)蛋白A2蛋白的表達(dá)量的變化進行Westenl Blot實驗驗證。(9)體內(nèi)殺傷實驗：①免疫C57BL/6小鼠：將BMDC與HBc-VLPs共孵育24小時，用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞成熟，將HBc-vLPs-BMDC(約3×106)皮下注射小鼠：②7天后，取正常C57BL/6小鼠脾細(xì)胞，HBc抗原肽刺激8小時后用5 nM5(6)-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(5(6)-CarboxyfluoresceinN-succinimidyl ester，CF

10、SE)標(biāo)記。用0.5 nM CFSE標(biāo)記未經(jīng)抗原肽刺激的淋巴細(xì)胞，將高、低濃度標(biāo)記的淋巴細(xì)胞按1:1比例混合后(約3-4×107)，靜脈注射給前期免疫的小鼠，12小時后，取脾臟，流式細(xì)胞儀檢測，按下列公式計算CTL殺傷百分率：CTL％=(1-CFSEhigh/CFSElow)×100。(10)數(shù)據(jù)統(tǒng)計：所有數(shù)據(jù)均用Student's t-test進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果：(1)原核表達(dá)系統(tǒng)pET28a-HBc重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)、Ni

11、-NTA親和層析純化：成功得到HBc蛋白。Western Blot實驗證實了變復(fù)性后的蛋白能被抗HBc單抗所特異性地識別。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)HBc蛋白能正確自主組裝成蛋白顆粒，顆粒大小約22 nm。(2)小鼠BMDC的成功培養(yǎng)：光學(xué)顯微鏡觀察證實體外培養(yǎng)BMDC的有DC的典型形態(tài)特征：流式細(xì)胞儀檢測BMDC表面標(biāo)志分子CD11c陽性表達(dá)率超過75％。(3)激光共聚焦顯微鏡觀察到HBc-VLPs能快速、大量被BMDC吞噬，表明體外培養(yǎng)的BMDC

12、有較強吞噬能力。(4)HBc-VLPs能誘導(dǎo)BMDC活化，提高其抗原提呈能力：流式細(xì)胞儀檢測untreated-BMDC組、HBc-VLPs-BMDC組、LPS-BMDC組的表面標(biāo)記分子CD86表達(dá)率分別為17-20％、42-45％、46-51％，CD80的表達(dá)率分別為16-17％、47-48.5％、56-58％，MHC-II分子的表達(dá)率分別為40-42.3％、63.5-68％、78-81％；RT-PCR結(jié)果證實HBc-VLPs-BMD

13、C組IL-12和IFN-γ的mRNA水平明顯高于untreated-BMDC組。(5)二維電泳檢測負(fù)載HBc-VLPs前后BMDC細(xì)胞總蛋白譜的差異表達(dá)。通過ImageMasterTM軟件對凝膠進行分析，每張凝膠上檢到500-600個點，凝膠間匹配率大于70％。HBc-VLPs-BMDC組和DPBS-BMDC組凝膠之間有8個蛋白點顯示3倍以上表達(dá)量差異。選取其中蛋白表達(dá)量較高的蛋白點6個，進行MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，并在UniPro

14、t和NCBInr數(shù)據(jù)庫中進行肽質(zhì)量搜索，得到4個己知蛋白：Isocitrate dehydrogenase 3(NAD+)alpha、isoformCRA_e、growth factor receptor bound protein 2、similar toEpiplakin、annexin A2。以內(nèi)參β-actin的表達(dá)量為參照，通過Western Blot驗證發(fā)現(xiàn)BMDC在攝取吞噬HBc-VLPs后Annexin-A2表達(dá)量減少。

15、(6)體內(nèi)殺靶的方法驗證HBc-VLPs負(fù)載的BMDC誘導(dǎo)特異性CTL活性：流式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)，直方圖顯示靶細(xì)胞的百分比(M2)。在未處理組、PBS處理組、HBc-VLPs負(fù)載的BMDC組M2范圍分別為46-49％、47-51％、17-19％。M2與被殺傷靶細(xì)胞的數(shù)量成反比，表明HBc-VLPs負(fù)載BMDC組可誘導(dǎo)高水平特異性CTL活性。 結(jié)論：(1)從大腸桿菌的包涵體成功獲得了高純度的HBc-VLPs。(2)形態(tài)學(xué)

16、觀察和細(xì)胞標(biāo)志分子的檢測表明在體外成功培養(yǎng)出小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞。(3)激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察證實，小鼠BMDC可在體外有效攝取HBc-VLPs；攝取后BMDC進一步成熟與活化細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD86、CD80、MHC-II表達(dá)增加，抗原提呈能力增強。(4)體內(nèi)殺傷實驗顯示：用HBc-VlPs負(fù)載的BMDC免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答，CTL活性增強。(5)二維電泳實驗發(fā)現(xiàn)：HBc-VLPs-BMDC組和untre

17、ated-BMDC組的蛋白譜存在若干表達(dá)差異的蛋白點。(6)蛋白質(zhì)譜分析出肽段，再從數(shù)據(jù)庫進行肽質(zhì)量搜索，得到4個己知蛋白Isocitratedehydrogenase 3(NAD+)alpha，isoform CRA_e、similar toEpiplakin、growth factor receptor bound protein 2、annexin A2。后2個蛋白在細(xì)胞的分化、增值、凋亡等過程中有重要的作用。(7)蛋白免疫印跡實