小麥高分子量谷蛋白亞基1Bx13和1By16單克隆抗體制備及其應(yīng)用研究.pdf

1、小麥的烘烤品質(zhì)不僅與貯藏蛋白的含量有關(guān)，而且還與其組成有關(guān)。烘烤品質(zhì)的測(cè)定通常需要比較昂貴的儀器，如：粉質(zhì)儀、拉伸儀、和面儀等，這些儀器難以在各育種單位普及。另外，利用上述儀器進(jìn)行分析時(shí)，需要較大的樣品量，這在育種的早代難以實(shí)現(xiàn)。雖然沉淀值、凱氏定N等方法較為經(jīng)濟(jì)，但其效率卻較低。最近，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，因具有成本低、耗費(fèi)少、所需樣品量少以及樣品處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已開始用于品質(zhì)預(yù)測(cè)和篩選。利用這種方法測(cè)定小麥品質(zhì)，關(guān)鍵是要

2、制備適宜的抗體，尤其是單克隆抗體。研究表明，HMW-GS1Bx13和1By16是對(duì)烘烤品質(zhì)影響較大的優(yōu)質(zhì)亞基，因此，制備這兩個(gè)亞基的單克隆抗體更有應(yīng)用價(jià)值。而且，由于這兩個(gè)亞基的基因還未克隆，以1Bx13和1By16亞基為抗原制備單克隆抗體還可以用于篩選cDNA表達(dá)文庫，從而克隆這兩個(gè)亞基及其它貯藏蛋白基因。 本研究以斯卑爾脫小麥Somiedo為材料，分別采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、酸性聚丙烯酰胺凝

3、膠電泳(A-PAGE)、雙向A-PAGE×SDS-PAGE、等電聚焦×SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(IEF×SDS-PAGE)、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)、高效液相色譜(HPLC)以及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)等方法對(duì)高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)進(jìn)行分離鑒定。采用電泳法分離純化1Bx13和1By16亞基，并以這兩個(gè)亞基為抗原免疫BALB/C小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備相應(yīng)抗原的單克隆抗體，并采用間接ELI

4、SA方法結(jié)合SPSS軟件分析，研究所制備單克隆抗體在預(yù)測(cè)小麥烘烤品質(zhì)及亞基鑒定方面的應(yīng)用。另外，還進(jìn)行了HMW-GS及LMW-GS抗原表位分析。主要研究結(jié)果如下： 1.HMW-GS的分離鑒定。目前，用于HMW-GS分離鑒定的方法較多，其中，以PAGE方法最為經(jīng)濟(jì)。雙向電泳(2-DE)的分辨率最高，且可對(duì)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行研究。HPLC不僅可用于分離鑒定，還可回收純化單個(gè)亞基，但所需流動(dòng)相量大，儀器比較昂貴，分析成本較高。HPCE

5、相對(duì)于HPLC來說較為經(jīng)濟(jì)，與PAGE相比可以避免有毒藥品的使用，因此是一種比較理想的分離鑒定HMW-GS的方法。本研究中的斯卑爾脫小麥Somiedo含有五個(gè)HMW-GS(1，13+16，2+12)，均能利用上述方法進(jìn)行分離鑒定。2-DE分析結(jié)果表明，從等電點(diǎn)來看，該品種所含有的HMW-GS主要分布在堿性區(qū)域，而且1Bx13和1By16較其它三條亞基的堿性更強(qiáng)。通過質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)獲得了1Bx13和1By16亞基的精

6、確分子量，分別為82.9249kD和77.0525kD。 2.1Bx13和1By16亞基的回收純化。特定HMW-GS的回收純化常用的方法有電泳法、電洗脫法以及反相高效液相色譜(RP-HPLC)法，其中以電泳法最為經(jīng)濟(jì)，其次是電洗脫法，RP-HPLC法效率最高，但所需儀器及費(fèi)用都比較昂貴。本研究以電泳法回收純化HMW-GS1Bx13和1By16，取得了較好的效果。 3.單克隆抗體的制備與鑒定?？贵w最常用的方法，本研究分別以

7、HMW-GS1Bx13和1By16為抗原，制備了4株單克隆抗體，分別命名為24231、24245、14587和14588。同13個(gè)小麥品種谷蛋白的免疫印跡結(jié)果顯示：以1Bx13亞基為抗原所獲得的兩株單克隆抗體24231和24245均與LMW-GS反應(yīng)強(qiáng)烈，而與HMW-GS反應(yīng)較弱；以1By16亞基為抗原所獲得的單克隆抗體14588與LMW-GS及部分HMW-GS反應(yīng)強(qiáng)烈，而與其它HMW-GS反應(yīng)較弱。另一株單抗14587與MW-GS1D

8、x的反應(yīng)明顯高于LMW-GS，而與其它HMW-GS無反應(yīng)。 4.單克隆抗體在小麥品質(zhì)預(yù)測(cè)及亞基鑒定中的應(yīng)用。單抗-麥谷蛋白ELISA吸附值與小麥品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析表明，所制備單克隆抗體與不同小麥品質(zhì)參數(shù)之間有一定的相關(guān)性，但因抗體、性狀及提取劑的不同而存在差異。就抗體而言，以24231和24245與品質(zhì)性狀的相關(guān)性最為密切，其次是14588，而抗體14587與所測(cè)品質(zhì)性狀無相關(guān)性。其中，抗體24231的ELISA吸附值與形成時(shí)

9、間呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.583，與穩(wěn)定時(shí)間呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.723；抗體24245的ELISA吸附值與形成時(shí)間和延伸性均呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.775和-0.686；抗體14588的ELISA吸附值與穩(wěn)定時(shí)間呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.625。就小麥品質(zhì)參數(shù)而言，以形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間與抗體的相關(guān)程度最高，其次是延伸性，而沉淀值、最大抗阻力以及蛋白含量在本實(shí)驗(yàn)中則無相關(guān)性。提取劑以酸化醇法效果較好，其次是鹽

10、酸法、SDS法和正丙醇法，但最佳提取劑還因抗體的不同而略有差異。例如，抗體24231在以3％SDS為提取劑時(shí)與品質(zhì)性狀的相關(guān)性最高，抗體14588則以鹽酸法為提取劑時(shí)與品質(zhì)性狀的相關(guān)性最高。由以上結(jié)果可以看出，這些抗體可作為有效的工具用于小麥品質(zhì)預(yù)測(cè)。 單抗14587同粗山羊草的反應(yīng)初步研究結(jié)果表明，該抗體與含有5+10亞基的粗山羊草之間反應(yīng)的ELISA吸附值明顯較含有2+12亞基的粗山羊草之間反應(yīng)的ELISA吸附值高，經(jīng)SPS

11、S軟件分析，差異達(dá)到顯著性水平。因此，該抗體有望用于區(qū)分含5+10亞基和2+12亞基的粗山羊草，在遠(yuǎn)緣雜交中的優(yōu)質(zhì)亞基鑒定與篩選等方面具有一定的利用價(jià)值。 5.HMW-GS及LMW-GS抗原表位分析。通過對(duì)13個(gè)常見HMW-GS以及21個(gè)面包小麥和硬粒小麥LMW-GS基因編碼蛋白的抗原表位分析，獲得HMW-GS、LMW-GS以及不同HMW-GS分別特有的抗原表位，可作為合成多肽抗原制備特異單克隆或多克隆抗體的依據(jù)，有助于提高所制