PEDV-TGEV-PDCoV快速檢測(cè)方法的建立及PEDV COE基因和ORF3基因遺傳變異研究.pdf

1、豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）和豬傳染性胃腸炎（Transmissible Gastroenteritis，TGE）分別是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Coronavirus，TGEV）引起的一種急性、高度接觸性腸道疾病。各個(gè)年齡段的豬均可以感染發(fā)病

2、，尤其以一周齡以內(nèi)的仔豬為主。豬丁型冠狀病毒又稱豬德?tīng)査跔畈《荆≒DCoV）是在美國(guó)PEDV暴發(fā)時(shí)期新發(fā)現(xiàn)的一種豬腹瀉病原，2013年至今，在豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎廣泛存在放的情況下，PDCoV也隨之出現(xiàn)。這三種病的臨床發(fā)病情況基本相似，均使發(fā)病豬呈現(xiàn)嘔吐和水樣腹瀉癥狀，一般的臨床癥狀較難鑒別。
　　為了快速鑒別診斷豬丁型冠狀病毒、豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎的流行和混合感染的情況，建立了一套能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)PEDV、TG

3、EV和PDCoV三重RT-PCR檢測(cè)方法。為了提高對(duì)PEDV檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性，避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中假陽(yáng)性的出現(xiàn)，建立了一套巢式 RT-PCR檢測(cè)方法，可用于較低濃度模板的PEDV的檢測(cè)。試驗(yàn)還對(duì)我國(guó)20株P(guān)EDV流行株的ORF3基因和COE基因分別進(jìn)行了遺傳變異分析。
　　根據(jù)冠狀病毒保守序列 N基因設(shè)計(jì)篩選出特異性高的三對(duì)引物，再進(jìn)行各種試驗(yàn)對(duì)不同反應(yīng)條件和體系進(jìn)行優(yōu)化，確定 PEDV、TGEV濃度為0.24μM，PDCoV濃度為

4、0.32μM；10×PCR緩沖液為1 mM，Taq DNA聚合酶終濃度為2.5U，dNTP終濃度0.2 mmol/L；退火溫度為56℃。用上述方法對(duì)PRRSV、CSFV、RV、PPV進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果為陰性；多重RT-PCR檢出PEDV、TGEV、PDCoV的最低含量分別為33.4pg、28.56pg、322.3pg。該方法敏感性和特異性較好，為今后各個(gè)地區(qū)腹瀉病原的快速準(zhǔn)確的鑒別診斷提供一個(gè)很好的方法。利用建立的三重RT-PCR方法和單重

5、RT-PCR分別對(duì)149份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，所有檢測(cè)樣品中PEDV陽(yáng)性率是46.3％，PDCoV陽(yáng)性率是1.4%，TGEV和混合感染在本次檢查中未檢出，且與單重RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果一致。
　　由于PEDV在模板含量較低時(shí)，用常規(guī)RT-PCR難以得到滿意的結(jié)果，本試驗(yàn)還建立了一套巢式RT-PCR。經(jīng)過(guò)特異性與靈敏性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)豬的其他病毒的擴(kuò)增為陰性；用常規(guī) RT-PCR能檢測(cè)出284pg/μL；而巢式 RT-PCR可以檢測(cè)

6、出2.84pg/μL，結(jié)果顯示它提高了反應(yīng)敏感性。
　　本試驗(yàn)對(duì)20株P(guān)EDV的ORF3基因和COE片段進(jìn)行了系統(tǒng)的遺傳變異分析。比較分析發(fā)現(xiàn)其核苷酸同源性95.5%~100%；氨基酸同源性為84.9%~100%（除JXNC和GDZH）；核苷酸和氨基酸與中國(guó)其他毒株存在相似的突變；ORF3基因進(jìn)化樹(shù)分析顯示，20株P(guān)EDV流行毒株均在G2分支上，與經(jīng)典毒株CV777親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與中國(guó)其他毒株親緣關(guān)系密切。PEDV ORF3基因的

7、特征可用于區(qū)分強(qiáng)弱毒，在ORF3基因第245~295位置處沒(méi)有49~51bp的缺失，說(shuō)明這20株流行株屬于強(qiáng)毒株。PEDV的S基因的抗原表位域（COE基因）分析顯示其核苷酸同源性95.8%~100%，氨基酸同源性為95.1%~100%；核苷酸和氨基酸分別有11個(gè)和5個(gè)共同突變位點(diǎn)；COE基因遺傳分析顯示，有兩株（JXTJ、JXBS）在G1分支上，其余18株均在G2上，和中國(guó)前幾年流行株與 DR13強(qiáng)毒株屬一個(gè)分支，與經(jīng)典毒株CV777親