甲狀腺相關(guān)眼病眼眶前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及原子力顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察.pdf

1、目的：研究眼眶前脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化的方法并對(duì)其進(jìn)行鑒定；探索利用原子力顯微鏡(Atomic forcemicroscopy，AFM)觀察人眼眶前脂肪細(xì)胞的最佳方法；利用AFM觀察甲狀腺相關(guān)眼病(Thyroid-associatedOphthalmopathy，TAO)患者和正常眼眶前脂肪細(xì)胞膜表面的形態(tài)學(xué)異同，利用AFM觀察TAO患者和正常眼眶前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞過(guò)程中細(xì)胞膜表面的形態(tài)學(xué)異同；并探討其可能的分化和發(fā)病機(jī)制

2、。 方法：①TAO患者手術(shù)切除的15例眼眶脂肪組織培養(yǎng)所獲的前脂肪細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，眼眶良性腫瘤手術(shù)中切除的15例正常脂肪組織培養(yǎng)所獲得的前脂肪細(xì)胞作為正常對(duì)照。 ②采用組織塊培養(yǎng)法和膠原酶消化法分離培養(yǎng)TAO患者及正常眼眶前脂肪細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察；通過(guò)MTT法觀察前脂肪細(xì)胞活力及生長(zhǎng)狀況；加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)分化因子，觀察人眼眶前脂肪細(xì)胞的增殖與分化過(guò)程；通過(guò)使用油紅O對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞脂質(zhì)含量的變化

3、；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞分化不同時(shí)期S-100蛋白的表達(dá)情況。 ③采用不同濃度戊二醛溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，摸索出適合AFM掃描的最佳固定濃度；用AFM觀察TAO與正常眼眶前脂肪細(xì)胞膜表面的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；甩AFM觀察分別在誘導(dǎo)分化的第2，8，16d TAO與正常眼眶前脂肪細(xì)胞膜表面形態(tài)學(xué)差異。 結(jié)果：①使用組織塊培養(yǎng)法和酶消化培養(yǎng)法從TAO患者和正常眼眶脂肪組織中均分離培養(yǎng)出大量螺旋狀生長(zhǎng)的長(zhǎng)梭形細(xì)胞。相較組織塊培養(yǎng)法，酶消

4、化法得到的細(xì)胞純度高，數(shù)量多，細(xì)胞形態(tài)好，適合于AFM標(biāo)本的制備。 ②使用酶消化法得到的前脂肪細(xì)胞特點(diǎn)：來(lái)源于脂肪組織，長(zhǎng)梭形；生長(zhǎng)曲線為“S”形，第3-11d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；免疫細(xì)胞化學(xué)S-100蛋白表達(dá)弱陽(yáng)性；誘導(dǎo)分化2d后細(xì)胞出現(xiàn)微小脂滴，脂滴數(shù)量逐漸增多，至分化第16d到達(dá)高峰，可被油紅O染為紅色，S-100蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加。 ③使用AFM觀察TAO患者及正常眼眶前脂肪細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)掃描范圍為80μm 時(shí)兩種細(xì)胞

5、均為長(zhǎng)梭形，細(xì)胞均直徑＞80μm，未觀察到明顯的差異。掃描范圍為1μm時(shí)兩種細(xì)胞表面出現(xiàn)大小不等的顆粒狀物質(zhì)，TAO患者細(xì)胞膜表面相對(duì)粗糙，隆起結(jié)構(gòu)起伏較大，排列疏密不均，其平均粗糙度為36.480±8.146nm；正常前脂肪細(xì)胞膜表面相對(duì)光滑，隆起結(jié)構(gòu)起伏較小，排列疏密均勻，其平均粗糙度為32.189±7.819nm；相比較兩組細(xì)胞膜粗糙度，TAO組較對(duì)照組粗糙度明顯增加(p＜0.01)。 ④使用AFM觀察TAO患者及正常眼眶

6、前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞的過(guò)程。發(fā)現(xiàn)掃描范圍為80μm時(shí)，隨著分化時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)均由梭形變?yōu)槎嘟切卧僮優(yōu)闄E圓形。掃描范圍為1μm時(shí)，分化第2，8，16d兩種細(xì)胞表面出現(xiàn)較密集的顆粒狀物質(zhì)，隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞膜表面粗糙變大，隆起變高，至16d達(dá)到高峰；TAO患者前脂肪細(xì)胞在同一時(shí)間膜表面粗糙度均大于正常細(xì)胞(p<0.05)。 結(jié)論：①酶消化法較組織塊法所得到的前脂肪細(xì)胞數(shù)量更多，純度更高。②前脂肪細(xì)胞在體外可被誘導(dǎo)分