應(yīng)用原子力顯微鏡對(duì)甲狀腺相關(guān)眼病外周血T淋巴細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、目的：甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)屬器官特異性自身免疫性疾病，眼球突出是其主要的臨床體征，發(fā)病率居成年組眼眶病之首，約占20％。該病通常存在自限性，只有不足10％的患者會(huì)出現(xiàn)視力模糊、視神經(jīng)障礙、角膜潰瘍、全眼球炎甚至失明等嚴(yán)重后果。國(guó)內(nèi)外一致認(rèn)為自身免疫性疾病是機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，以致破壞自身正常組織結(jié)構(gòu)并引起相應(yīng)的臨床癥狀。TAO在環(huán)境、遺傳等背景存在

2、下，自身耐受遭到破壞，機(jī)體對(duì)自身抗原識(shí)別，產(chǎn)生了自身反應(yīng)性T細(xì)胞，在多種細(xì)胞因子作用下，T細(xì)胞活化、遷移至眶后組織，引起特定組織損傷，導(dǎo)致疾病發(fā)生。臨床實(shí)踐中我們對(duì)TAO患者的T細(xì)胞活化狀態(tài)的準(zhǔn)確評(píng)估是獲得較好療效的前提。對(duì)于活動(dòng)期TAO患者多采用皮質(zhì)類(lèi)固醇和免疫抑制劑藥物聯(lián)合應(yīng)用，輔以局部放療，小劑量化療；而對(duì)于靜止期的患者，藥物療效并不明顯，在壓迫性視神經(jīng)病變引起視力急劇下降的情況下可采取提上瞼肌延長(zhǎng)術(shù)及眶減壓術(shù)等手術(shù)治療方案。

3、 T細(xì)胞膜表面存在IL-2受體α鏈(CD25)，該CD分子的表達(dá)為T(mén)細(xì)胞激活的第一事件，在維持自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy，AFM)對(duì)TAO患者外周血T細(xì)胞的膜表面進(jìn)行觀測(cè)，第一部分比較正常組與TAO患者T細(xì)胞之間的差異，探索可供研究的參數(shù)指標(biāo)；第二部分進(jìn)一步觀測(cè)靜脈注射激素治療TAO患者用藥前后，T細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)是否存在變化，這些改變是否能夠通過(guò)AFM所提供的參數(shù)

4、客觀的表現(xiàn)出來(lái)；第三部分初步探索T細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu)改變與CD25分子含量的相關(guān)性，探討AFM所觀測(cè)的指標(biāo)是否可以作為反映細(xì)胞功能活化狀態(tài)的客觀依據(jù)，從而能夠反映TAO免疫活動(dòng)程度。 方法：將研究對(duì)象分為三組：正常對(duì)照組(n=12例)、TAO活動(dòng)期組(n=18例)和TAO靜止期組(n=22例)。 1、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離：取晨起空腹肝素抗凝外周血3ml，用PBS緩沖液稀釋到2倍體積，充分混勻后沿管壁緩慢地加入事先已裝有

5、3ml聚蔗糖--泛影葡胺淋巴細(xì)胞分離液的14ml一次性離心管內(nèi)，水平式轉(zhuǎn)頭500xg離心20min，取懸浮于血漿與分層液的界面之間灰白層，移入另一離心管，用5倍以上PBS緩沖液充分洗滌，200xg離心10 min，2次。 2、Dynal免疫磁珠分離純化T細(xì)胞：將分離得到的單個(gè)核細(xì)胞沉淀放置于4℃下，加入一定量Dynabeads(72μlbeads/ml PBMC)再加入1 ml左右的PBS(2％FCS)重懸細(xì)胞：把裝有此混合液的

6、試管置于DynalMPC上2～3 min；棄去懸浮液，T細(xì)胞黏附在試管與DynalMPC接觸的一側(cè)；上述細(xì)胞懸浮液每100μl加入10μDETACHaBEAD，放置室溫孵育45～60min，不斷溫和混勻；再置于DynalMPC上2min；吸取懸浮液至新的試管中。 3、將獲得的T細(xì)胞一部分用于活性檢測(cè)和鑒定：臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性；HE、免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定T細(xì)胞，流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)CD3+T細(xì)胞的純度。 4、細(xì)胞培

7、養(yǎng)：將試管中其余所有T細(xì)胞置于5％CO2的孵箱中，于37℃培養(yǎng)48h。 5、AFM樣品的制備和觀測(cè)：將培養(yǎng)細(xì)胞離心，用2.5％戊二醛溶液中固定30min，在三蒸水中浸泡過(guò)夜，載玻片置于超凈臺(tái)空間下自然晾干。AFM選擇Tapping模式，對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行整體掃描，然后選擇最亮區(qū)域改變掃描范圍為1um，掃描速率為2Hz進(jìn)行局部掃描。一個(gè)血樣制成一個(gè)樣本，每個(gè)樣本掃描10個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞掃描20個(gè)區(qū)域，求平均數(shù)代表一個(gè)樣本的測(cè)量數(shù)，圖像

8、經(jīng)儀器平滑處理。數(shù)據(jù)采集和分析。 6、應(yīng)用上述方法對(duì)TAO活動(dòng)期患者大劑量激素沖擊治療前后T細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比觀測(cè)。 7、應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)得TAO外周血T細(xì)胞CD25分子表達(dá)百分含量，與AFM所測(cè)得的參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果：1、經(jīng)常規(guī)分離、培養(yǎng)的正常組和TAO組兩個(gè)分期的T細(xì)胞在形狀上均呈現(xiàn)較為規(guī)則的圓形；正常組T細(xì)胞直徑約在5-8um，高度在600-850nm之間，表面總體較光滑但其超微結(jié)構(gòu)也并非完全均一，而TA

9、O急性期T細(xì)胞直徑偏大，約在9-11um之間，表面的凹凸不平較明顯，出現(xiàn)明顯的顆粒狀突起及凹陷，邊緣還可觀察到有細(xì)微的樹(shù)枝狀突起分布；靜止期的T細(xì)胞直徑略小，約在8-10um之間，而膜表面的粗糙程度介于正常組和TAO急性期組之間。 2、應(yīng)用單因素方差分析將三組T細(xì)胞的觀測(cè)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)果：Ra、Peak count、Rpm、Rvm、Surface areadiff在α=0.05水平上，P<0.00，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有顯

10、著差異。 3、應(yīng)用多個(gè)樣本間均數(shù)比較，Peak count，Surface areadiff在三組間均存在差異，即正常對(duì)照組、TAO活動(dòng)期組和靜止期組兩兩之間存在差異。 4、經(jīng)過(guò)大劑量沖擊治療后，T細(xì)胞的直徑變小，約為9-11um，表面的凹凸不平的程度也較治療前有所下降。對(duì)AFM測(cè)量的指標(biāo)，進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，Peak count、Rpm、Rvm、Surface area diff存在顯著性差異，表明活動(dòng)期TAO患者激素治療

11、前后外周血T細(xì)胞膜表面存在超微結(jié)構(gòu)的改變。 5、應(yīng)用多元線性回歸以及曲線擬合方法，分析膜表面參數(shù)中Peak count、Rpm、Rvm、Surface area difr與T細(xì)胞膜表面CD25分子的相關(guān)性。 CD25與AFM所測(cè)參數(shù)Rvm、Surface area diff、Peakcount均存在相關(guān)性，運(yùn)用逐步回歸分析Rvm(x2)、peakcount(x1)，建立回歸方程：Y=0.188x1+0.56X2-0.21

12、9，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為Rvm、peakcount可以作為衡量CD25表達(dá)含量多少的參考指標(biāo)。 結(jié)論：1、正常對(duì)照組與TAO活動(dòng)期和靜止期的T細(xì)胞在大小、膜表面超微結(jié)構(gòu)均存在不同。經(jīng)過(guò)多個(gè)樣本間均數(shù)比較，有一些指標(biāo)在三組之間存在兩兩差異，而一些指標(biāo)在TAO靜止期組和正常對(duì)照組之間并無(wú)差異，提示我們雖然靜止期TAO的T細(xì)胞活性不如活動(dòng)期表現(xiàn)明顯，但是免疫系統(tǒng)仍處在某種不平衡的異常狀態(tài)，可能只是細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能有所減退。 2、使用激