肝細(xì)胞去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的乳糖基白蛋白-SPIO檢測微小肝癌的MR成像研究.pdf

1、研究目的： 1、收集人體肝占位新鮮手術(shù)標(biāo)本，分別與普通SPIO和Lac-HSA-SPIO結(jié)合，行組織化學(xué)染色，體外評價Lac-HSA-SPIO的受體的結(jié)合能力及區(qū)分不同肝實(shí)質(zhì)病變的可能性； 2、建立二乙基亞硝胺(DENA)誘導(dǎo)的大鼠肝硬化肝細(xì)胞癌模型和種植Vx2瘤大鼠肝癌模型，評價乳糖基白蛋白超順磁性氧化鐵粒子(lactosmitedhumanserumalbumincoatedSPIO，簡稱Lac-HSA-SPIO)在

2、肝癌MR掃描中的檢出和診斷價值。 材料與方法： 1、人肝臟正常組織及病變新鮮標(biāo)本受體分布實(shí)驗(yàn) (1)收集人體肝臟正常及病變手術(shù)新鮮標(biāo)本：收集手術(shù)新鮮標(biāo)本，其中肝細(xì)胞癌標(biāo)本7例，膽管細(xì)胞癌標(biāo)本2例，肝血管瘤2例，肝結(jié)節(jié)狀增生標(biāo)本5例，肝臟邊緣相對正常肝組織4例。手術(shù)后1小時內(nèi)放入-80℃冰箱中備用。所有標(biāo)本均有我院完整影像資料。 (2)人肝臟不同標(biāo)本受體分布實(shí)驗(yàn)：取出低溫貯藏的人肝不同標(biāo)本，冷凍切片(2-4

3、μm)，在室溫下溶解，4℃自然干燥。每種腫瘤分別取三個切片，一個進(jìn)行HE染色，另外兩個切片一個滴加非肝細(xì)胞受體對比劑SPIO，一個滴加Lac-HSA-SPIO，均于37℃干燥孵育15分鐘，用生理鹽水洗3遍，去除未結(jié)合的SPIO或L,ac-HSA-SPIO，室溫風(fēng)干6小時，用PerlsPrussian藍(lán)染色。顯微鏡下觀察。 2、Lac-HSA-SPIO在大鼠肝癌模型的應(yīng)用 (1)化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型的建立： 二乙

4、基亞硝胺分析純(DENA，Diethylnitrosamine，美國Sigma公司，純度大于99％，0.95g／ml)1.0ml加入10.0L水配制成100ppm(百萬分子一)水溶液讓大鼠自由飲用，12周后改為正常飲用水；DENA溶液隔日更換一次，避光保存。 大鼠肝臟VX2種植瘤模型的建立：從VX2荷瘤種兔腫瘤邊緣切取魚肉樣組織，剪成0.5-1mm3瘤塊，放入少量生理鹽水中備用。實(shí)驗(yàn)SD大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，開腹，暴露

5、腹腔，大鼠肝臟體積小，分葉較多，用手指輕輕將靠近腹壁的肝葉輕輕牽出體外，以眼科鑷于肝葉較厚位置輕輕刺破組織形成竇道，將1-2粒VX2瘤塊埋入其中，確定止血、無瘤塊滑出后將肝臟送回腹腔，然后逐層關(guān)腹。肌肉注射青霉素。10-14天后用于MR掃描。 (2)動物分組： 14只成功建立VX2瘤的肝癌模型的大鼠隨機(jī)分成2組，用于SPIO灌注組7只，用于Lac-HSA-SPIO灌注組7只；12只建立了化學(xué)誘導(dǎo)原發(fā)性肝硬化肝癌模型的大鼠

6、隨機(jī)分成2組，用于SPIO灌注組6只，用于Lac-HSA-SPIO灌注組6只。 (3)MRI掃描： 采用腹部小型軟線圈定位，層厚3mm，F(xiàn)OV16×16mm，平掃序列有：自旋回波(spinecho，SE)序列T1WI(TR／TE：500ms／17ms)，F(xiàn)GR序列／30(FastGRASS)T1WI(TR／TE：260s／2.9ms)，快速自旋回波(fastspinecho，F(xiàn)SE)序列T2WI(TR／TE：4500ms

7、／152ms)；快速恢復(fù)快速自旋回波(fastrecoveryfastspinecho-accelerated，F(xiàn)RFSE)序列(TR3600ms，TE85.8ms)T2WI；FGR序列T2WI(TR／TE：600ms／15ms)。增強(qiáng)掃描：兩種肝癌模型的SPIO灌注組，經(jīng)大鼠尾靜脈緩注射SPIO對比劑，15分鐘后行SPIO增強(qiáng)掃描；兩種肝癌模型的Lac-HSA-SPIO灌注組，經(jīng)大鼠尾靜脈緩注射Lac-HSA-SPIO對比劑，30分鐘

8、后行Lac-HSA-SPIO增強(qiáng)掃描。增強(qiáng)掃描條件同平掃一致。 (4)圖像觀察與測量： 所有序列MR圖像由三位南方醫(yī)院影像中心磁共振醫(yī)師共同閱片。測量病灶數(shù)量、大小(最大徑)：測量病灶及周圍肝實(shí)質(zhì)感興趣區(qū)平均信號強(qiáng)度、背景噪聲，噪聲感興趣區(qū)放在與病灶同一相位編碼方向腹前壁之外的鄰近背景處。計算每個序列圖像上病灶的信噪比(SNR)、病變與肝臟對比噪聲比(CNR)、增強(qiáng)前后CNR的變化差值。 (5)統(tǒng)計學(xué)比較：

9、 應(yīng)用SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，采用配對t檢驗(yàn)(Paired-SamplesTTest)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-SamplesTTest)，P(0.05認(rèn)為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)果： 1、Lac-HSA-SPIO介導(dǎo)的人肝臟標(biāo)本的受體分析結(jié)果 正常肝組織SPIO孵育后肝細(xì)胞膜及胞內(nèi)均未見藍(lán)染色，正常肝組織Lac-HSA-SPIO孵育后肝細(xì)胞膜及胞內(nèi)可見大量藍(lán)染色；肝結(jié)節(jié)狀增生組織S

10、PIO和Lac-HSA-SPIO孵育可見藍(lán)染顆粒散在分布；高分化肝細(xì)胞癌組織SPIO和Lac-HSA-SPIO孵育后肝細(xì)胞膜及胞內(nèi)可見極少量藍(lán)染顆粒，低分化肝細(xì)胞癌組織SPIO和Lac-HSA-SPIO孵育后肝細(xì)胞膜及胞內(nèi)無藍(lán)染色；膽管細(xì)胞癌組織、肝血管瘤組織經(jīng)SPIO和Lac-HSA-SPIO孵育后無藍(lán)色。 2、大鼠肝癌模型MR成像結(jié)果 (1)14只VX2肝癌模型，MR檢出腫瘤21個，其中SPIO組檢出9個，病理解剖9

11、個，Lac-HSA-SPIO組12個，病理解剖12個。 12只化學(xué)誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌模型，MR檢出腫瘤13個，其中SPIO組檢出6個，病理解剖9個，Lac-HSA-SPIO組7個，病理解剖9個。各個序列MR圖像較清楚顯示共計34個病灶，其中最小直徑為0.3cm，最大為1.4cm，病理解剖病灶中最小直徑0.2cm，最大1.5cm。 (2)組織病理學(xué)HE染色，VX2腫瘤組織以鱗癌為主，周圍肝組織基本正常，部分腫瘤周圍可見纖維組織

12、增生、形成纖維性假包膜；化學(xué)誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌組，肝癌組織失去正常結(jié)構(gòu)，組織疏松，肝癌細(xì)胞體積明顯增大，異型性明顯，胞核嗜堿性增強(qiáng)，可見多核及異型核，血竇明顯擴(kuò)張增多，周圍肝組織呈肝硬化表現(xiàn)，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞體積稍增大，部分腫脹，纖維組織增多，匯管區(qū)可見較多炎性細(xì)胞。 (3)肝臟SNR、CNR測量結(jié)果VX2種植瘤組，SPIO增強(qiáng)后T2WIFSE序列肝癌的SNR較增強(qiáng)前有顯著差異(P=0.012)，SPIO增強(qiáng)后T2WIFR

13、FSE序列、T2WIFGR序列及Lac-HSA-SPIO增強(qiáng)后的所有序列肝癌的SNR較增強(qiáng)前均無顯著差異(P>0.05)。 化學(xué)誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌組，SPIO增強(qiáng)后T2WIFGR序列和Lac-HSA-SPIO增強(qiáng)后T2WIFSE序列肝癌的SNR較增強(qiáng)前有顯著差異(P<0.05)，SPIO組和Lac-HSA-SPIO組的其它序列肝癌的SNR較增強(qiáng)前均無顯著差異(P>0.05)VX2種植瘤組，SPIO增強(qiáng)前后腫瘤-肝臟CNR有所提高，統(tǒng)

14、計學(xué)分析有顯著差異(P<0.05)，LaC-HSA-SPIO增強(qiáng)前后腫瘤-肝臟CNR明顯提高，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著差異(P<0.05)，且Lac-HSA-SPIO增強(qiáng)前后腫瘤-肝臟CNR增高的差值高于SPIO增強(qiáng)前后腫瘤-肝臟CNR增高的差值，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有顯著差異(P<0.05)。 化學(xué)誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌組，SPIO增強(qiáng)前后腫瘤-肝臟CNR有所提高，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著差異(P<0.05)，Lac-HSA-SPIO增強(qiáng)前后腫瘤-肝臟CNR

15、明顯提高，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著差異(P<0.05)，且Lac-HSA-SPIO增強(qiáng)前后腫瘤-肝臟CNR變化的差值分別高于SPIO增強(qiáng)前后腫瘤一肝臟CNR變化的差值，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著差異(P<0.05)。 VX2種植瘤組和化學(xué)誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌組均顯示Lac-HSA-SPIO增強(qiáng)后腫瘤一肝臟CNR明顯提高，且腫瘤-肝臟CNR提高的差值高于SPIO增強(qiáng)組。 結(jié)論： 1、Lac-HSA-SPIO與肝細(xì)胞ASGP受體具有良好的結(jié)

16、合活性，可以被肝臟正常細(xì)胞攝取，在肝臟正常組織和肝硬化組織中廣泛分布，但在肝癌組織和非肝細(xì)胞組織中缺乏分布，相對SPIO只被肝臟Kupffer。細(xì)胞吞噬，更具有肝臟組織分布特異性。 2、肝臟不同病變組織ASGP受體分布不同，因此Lac-HSA-SPIO在肝實(shí)質(zhì)良惡性腫瘤中的分布有一定差異，為鑒別不同肝實(shí)質(zhì)病變提供潛在價值。 3、MR掃描示大鼠VX2種植瘤模型組和化學(xué)誘導(dǎo)肝硬化肝癌模型組Lac-HSA-SPIO增強(qiáng)后腫瘤-