空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中塵螨變應原的應用基礎研究.pdf

1、背景:變態(tài)反應疾病(過敏性疾病)被世界衛(wèi)生組織認為是當前世界性的重大衛(wèi)生學問題，世界各國變態(tài)反應性疾病的總發(fā)病率高達10-30％。近些年來其發(fā)病率在逐步增高。在引起過敏性疾病眾多吸入性變應原中，塵螨是導致呼吸道變態(tài)反應性疾病的最重要因素。與過敏性疾病有關的塵螨主要為屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus，Derp)和粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae，Derf)。它們喜好在溫暖、潮濕環(huán)境中

2、繁衍，以人或動物的皮屑、指甲及毛發(fā)為主要食物，多藏匿于床褥、枕頭、地毯、衣服、毛絨玩具或家具內(nèi)。 隨著社會生活水平的提高，空調(diào)已成為城市家庭的必備電器，且人們在密封空調(diào)環(huán)境內(nèi)工作、生活和學習時間越來越長。本課題組在前期研究過程中，偶然發(fā)現(xiàn)空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中存在大量的塵螨?？照{(diào)濾網(wǎng)灰塵是否也是塵螨嗜好的棲居場所之一及其季節(jié)消長規(guī)律和分布規(guī)律、該塵螨變應原(即塵螨的分泌物、排泄物以及死亡降解產(chǎn)物)是否經(jīng)空調(diào)送風而排入室內(nèi)空氣中，國內(nèi)外目

3、前尚未見報道。 國外已有以酶聯(lián)免疫方法開發(fā)的商品化的檢測塵螨主要變應原的試劑盒供應，但存在價格昂貴(約五百英磅一盒)，在國內(nèi)沒有代理點等問題而未能在我國廣泛應用。在國內(nèi)尚未見對于定量檢測塵螨變應原含量方法學研究的報道。研究目的 1.探討空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中塵螨的季節(jié)性消長規(guī)律和分布地域性差異，為進一步預防過敏性疾病(如哮喘、過敏性鼻炎等)和防螨空調(diào)的研制提供理論依據(jù)。 2.探討空調(diào)濾網(wǎng)中塵螨變應原與哮喘發(fā)病的關系，為哮

4、喘患者制定防螨措施做好變應原回避提供重要的參考依據(jù)。 3.建立檢測環(huán)境中屋塵螨2組變應原(Derp2)含量的雙抗體夾心ELISA法。研究內(nèi)容與方法于2004年8月份在北京、上海、南昌、廣州、深圳五個城市，用隨機抽樣方法選擇319臺家庭空調(diào)(北京48臺，上海55臺，南昌72臺，廣州60臺，深圳84臺)，進行空調(diào)濾網(wǎng)灰塵的采集，稱重后在解剖鏡下對灰塵中塵螨進行計數(shù)、封片，在光鏡下進行形態(tài)學鑒定。其中深圳地區(qū)進行為期一年(2004年7

5、月至2005年6月)的實驗，共采集了232份樣品。用IndoorBiotechnologies公司的試劑盒對采集回來的空調(diào)濾網(wǎng)灰塵樣品進行塵螨主要變應原(屋塵螨1組變應原(Derp1)、粉塵螨1組變應原(Derf1)和塵螨2組變應原(Der2)的定量檢測。采集廣州地區(qū)30例哮喘患者和30例正常家庭臥室空調(diào)開機前后空氣中的灰塵及空調(diào)濾網(wǎng)灰塵，采用IndoorBiotechnologies公司的試劑盒檢測其Derf1、Derp1和Der2的

6、濃度。以終濃度為0.5mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG)對本實驗室保存重組子BL21star/pET24a/Derp2進行誘導表達，得到的蛋白經(jīng)Ni-NAT純化后梯度透析復性。采用塵螨過敏病人血清進行蛋白印跡(Western-Blotting)檢測。用純化后的重組Derp2蛋白(rDerp2)免疫新西蘭兔得到抗Derp2多克隆血清，經(jīng)檢驗合格后用飽和硫酸銨(

7、NH4)2SO4進行鹽析沉淀，脫鹽后以70mmol/LPH6.3的PB對DEAE-SepharoseF.F陰離子交換層析柱進行純化，再用過碘酸鈉氧化法進行辣根過氧化物酶(HRP)標記，此酶標抗體為雙抗體夾心法的檢測抗體。用DMEM培養(yǎng)Derp2單克隆抗體，用ProteinA親和層析柱純化，作為捕獲抗體。用棋盤滴定法測定包被抗體的最佳濃度及酶結合物的最佳稀釋度而建立檢測Derp2的雙抗體夾心ELISA方法。 研究結果1.空調(diào)濾網(wǎng)灰

8、塵中存在塵螨變應原，其分布有明顯的季節(jié)性特征，每年最早在3月份即可出現(xiàn)，7、8月份達高峰，11月份消失。 2.廣州、深圳地區(qū)空調(diào)濾網(wǎng)灰塵以粉塵螨為主，屋塵螨次之；南昌、上海地區(qū)空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中屋塵螨比粉塵螨略多；北京地區(qū)沒有檢出螨蟲。 3.廣州地區(qū)家庭空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中Derp1、Derf1和Der2濃度分別為0.84±0.74、3.17±2.01、2.91±2.14ug/g灰塵，深圳地區(qū)分別為1.68±1.31、3.14±2

9、.75、2.75±1.82ug/g灰塵，南昌地區(qū)分別為3.51±2.39、1.91±1.30、2.25±1.78ug/g灰塵，上海地區(qū)分別為3.09±2.10、1.62±1.58、2.40±1.88ug/g灰塵。四個城市家庭空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中的Der2、廣州與深圳地區(qū)的Derf1、上海與南昌地區(qū)的Derp1含量均高于引起塵螨過敏性疾病致敏的閾值2μg/g灰塵。4.哮喘患者家庭空調(diào)開機前空氣中Derp1、Derf1和Der2的濃度分別為0.2

10、3±0.07，2.62±1.08，0.92±0.41ng/m3，開機后三者的濃度分別為0.49±0.25，3.73±1.22，1.35±0.81ng/m3，三者的濃度開機前后相比差別均有顯著性意義(P＜0.05)；正常家庭哮空調(diào)開機前空氣中Derp1、Derf1和Der2的濃度分別為0.33±0.19，5.21±2.36，2.77±1.16ng/m3，開機后三者的濃度分別為0.48±0.23，7.18±3.33，4.18±1.61ng/

11、m3，三者的濃度開機前后相比差別均有顯著性意義(P＜0.05)。5.棋盤滴定法顯示包被用的Derp2單克隆抗體最佳工作濃度為1ug/ml，HRP標記的抗Derp2多克隆抗體的最佳稀釋度為1∶1000。建立的雙抗體夾心法檢測極限為2ng/ml，與參考標準方法相比，特異性為0.876，敏感性為0.900，準確性為0.886，χ2檢驗得P＞0.05，新建立的雙抗體夾心ELISA方法與參考標準方法檢出率無差別。 結論1.首次證實空調(diào)濾網(wǎng)

12、灰塵中存在塵螨變應原，并有明顯的季節(jié)消長規(guī)律和地區(qū)分布特征，優(yōu)勢螨種是粉塵螨與屋塵螨。 2.空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中塵螨變應原隨空調(diào)送風而排入室內(nèi)空氣中?？照{(diào)是室內(nèi)塵螨變應原的重要來源之一，其濾網(wǎng)灰塵中塵螨變應原的存在是引起過敏性疾病的重要誘因之一。 3.國內(nèi)首次制備出Derp2多克隆抗體；成功培養(yǎng)出Derp2單克隆抗體。 4.建立了檢測塵螨Derp2變應原的雙抗體夾心法ELISA法。該方法操作簡單，重復性好，靈敏度高，可