特比萘芬與伊曲康唑聯(lián)合抗Fonsecaea monophora體內(nèi)療效及體外藥敏評價(jià).pdf

1、一、研究背景 著色芽生菌病是由著色真菌侵犯皮膚深部組織所引起的疾病，該病在熱帶、亞熱帶和溫帶常見。其致病菌主要包括著色霉屬(裴氏著色霉、緊密著色霉)、枝孢霉屬(卡氏枝孢霉)、喙枝孢霉屬(播水喙枝孢)及瓶霉屬(疣狀瓶霉)等；在空氣干燥的寒溫帶卡氏枝孢霉是常見致病菌，而在濕熱帶裴氏著色真菌是主要致病菌。在我國北方以卡氏枝孢霉引起著色芽生菌病最多見，而南方，尤其兩廣、福建一帶則以裴氏著色真菌引起多見。Fonsecaea monopho

2、ra為近年荷蘭學(xué)者De Hoog首次報(bào)道的從裴氏著色霉中分離出的一個(gè)新的菌種，F(xiàn)onsecaea monophora與裴氏著色霉在形態(tài)學(xué)上有極高的相似性，而在致病性上Fonsecaea monophora更可能是機(jī)會性感染菌。臨床表現(xiàn)上Fonsecaea monophora的變異更大，并有親中樞神經(jīng)性。國外已見Fonsecaea monophora致中樞感染報(bào)道。我科近10年確診約20余例著色芽生菌病，病原菌最初均報(bào)道為裴氏著色霉。但近

3、期的DNA序列分析證實(shí)部分裴氏樣著色霉是Fonsecaea monophora。外傷植入可能是著色芽生菌病的感染途徑，皮損隨著疾病的進(jìn)展可表現(xiàn)多型性損害，最終形成纖維化、水腫。由于感染性肉芽腫和組織纖維化形成導(dǎo)致其治療尤其是根治非常困難。著色芽生菌病的治療效果常與菌種，皮疹的嚴(yán)重度及選用的抗真菌藥物有關(guān)。卡氏枝孢霉對藥物治療更敏感，而皮損部位的水腫、纖維化減少了藥物的組織濃度也增加了治療的困難。文獻(xiàn)報(bào)道的治療方法包括靜脈給藥：兩性霉素B

4、，口服給藥：特比萘芬250-500 mg／天；伊曲康唑200—400 mg／天；5-氟胞嘧啶聯(lián)合特比萘芬或伊曲康唑等，外科方法：手術(shù)切除、冷凍或熱療。在疾病的早期外科切除、局部熱療和液氮冷凍治療可取得一定的效果，但隨著病情嚴(yán)重度的增加，藥物治療成為獲得理想療效的重要的不可缺少的選擇。一些新的抗真菌藥：伏立康唑、泊沙康唑及棘白霉素在體外藥敏試驗(yàn)中均顯示對絲狀真菌的高度抗菌活性，但它們在治療著色芽生菌病中的有效性尚有待進(jìn)一步證實(shí)。目前認(rèn)為伊

5、曲康唑或特比萘芬持續(xù)給藥是治療該病的較理想的方法，但缺乏標(biāo)準(zhǔn)的治療方案，且復(fù)發(fā)常有發(fā)生，部分病例對傳統(tǒng)的單一抗真菌治療顯示無效。因此，一些學(xué)者開始探討聯(lián)合應(yīng)用抗真菌藥治療著色芽生菌病的有效性。已有文獻(xiàn)報(bào)道伊曲康唑與特比萘芬聯(lián)合在體外對白念珠菌、Scedosporium prolificans、Pythium insidiosum均有協(xié)同抗菌活性，伊曲康唑與特比萘芬有協(xié)同作用的分子機(jī)制可能在于二者阻斷了真菌類固醇合成的共同通路中不同的作用

6、點(diǎn)。藥敏研究證實(shí)伊曲康唑與特比萘芬聯(lián)合抗念珠菌，其最小抑菌濃度僅為原劑量的四分之一，Ryder等體外研究證實(shí)伊曲康唑與特比萘芬聯(lián)合抗曲菌有協(xié)同作用。個(gè)別文獻(xiàn)報(bào)道亦提示聯(lián)合抗真菌藥治療著色芽生菌病的有效性，巴西學(xué)者Gupta等聯(lián)合應(yīng)用伊曲康唑與特比萘芬成功治愈4例既往用單一抗真菌藥無效的裴氏著色霉所致著色芽生菌病患者，但聯(lián)合抗真菌藥治療著色芽生菌病的有效性尚需更多的臨床資料證實(shí)。 Fonsecaea monophora為近年從裴氏著色霉中

7、分離出的一個(gè)新的菌種，目前尚缺乏相關(guān)的體內(nèi)、體外藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為了探討更理想的治療著色芽生菌病的臨床方案，本研究采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會制定的M38-A方案研究了伊曲康唑和特比萘芬在體外對18株Fonsecaea monophora的抑菌作用和聯(lián)合用藥時(shí)藥物間相互作用；并回顧分析了5例患者臨床療效與方案，以期為今后的臨床用藥提供更好的參考。 二、研究目的 1.觀察伊曲康唑、特比萘芬單用及聯(lián)合應(yīng)用對Fonsecaea

8、 monophora的體外藥敏作用。 2.回顧分析5例患者的MIC值與與臨床治療方案、療效的關(guān)系，其中4例患者資料完整作病例報(bào)道。 3.探討聯(lián)合用藥在治療著色芽生菌病中的意義。 三、實(shí)驗(yàn)對象和方法　　1.菌懸液制備：18株Fonsecaea monophora菌株均接種在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)上35℃培養(yǎng)7-10天活化2次，以保證其純度和活力，取1ml 0.85％含吐溫的生理鹽水加入試管內(nèi)，輕抽吸后，將菌

9、液吸到無菌試管中靜置3-5分鐘，再取上層懸浮液窩懸15秒，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整菌懸液濃度至106CFU／ml，再用RPMI 1640液體培養(yǎng)基稀釋50—100倍，得到0.5—5×104CFU／ml的2倍終濃度的接種菌懸液。 2.使用一次性無菌96孔平底板進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。首行(首列)第一孔作為陰性對照，為200μl含1％DMSO的RPMI1640培養(yǎng)液；第8行(第12列)為生長對照，為100μl含2％DMSO的RPMI1640培

10、養(yǎng)液；第一行的2-11孔和第一列的2—8孔為單獨(dú)用藥的2倍終濃度的藥物稀釋液100 μl；其余孔為兩藥聯(lián)合時(shí)的4倍終濃度的藥物稀釋液50 μl。微稀釋板置-80℃保存?zhèn)溆?。在加入接種菌懸液100 μl后聯(lián)合藥敏試驗(yàn)藥物最終濃度范圍：特比萘芬和伊曲康唑均是0.002-1 μg／ml。 3.接種、培養(yǎng)和結(jié)果的判讀：除陰性對照孔外，每孔加入2倍終濃度菌懸液100μl，35℃培養(yǎng)，5—7天觀察結(jié)果。以肉眼觀察所見能100％抑制真菌生長的

11、最低藥物濃度為MIC終點(diǎn)。 4.藥物相互作用分析：應(yīng)用分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)(the fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)描述藥物間相互作用。表達(dá)式為FICI=CAcomb／MICAalone+CBcomb／MICBalone，MICAalone和MICBalone。是藥物A和藥物B單獨(dú)用藥時(shí)各藥的MIC值；CAcomb和CBcomb是藥物A和藥物B聯(lián)合用藥時(shí)各藥的MIC值。F

12、ICI值的解釋為：FICI<0.5有協(xié)同作用，F(xiàn)ICI≥0.5但<1.0有相加作用，F(xiàn)ICI≥1.0但<4為無關(guān)作用，F(xiàn)ICI≥4有拮抗作用。 5.回顧分析5例患者的MIC值與與臨床反應(yīng)的一致性，其中4例患者資料完整作病例報(bào)道。 6.統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選擇配對資料的Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)α設(shè)為0.05。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.質(zhì)控株近平滑念珠菌ATCC22

13、019在每次的藥敏試驗(yàn)中均進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，該菌株在35℃、48 h培養(yǎng)后均生長良好，該質(zhì)控株的伊曲康唑的MIC值范圍是0.125-0.25 μg／ml。特比萘芬的MIC質(zhì)控范圍是>8 μg／ml。聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示有協(xié)同作用，其FICI范圍是0.31-0.38。 2.特比萘芬和伊曲康唑聯(lián)用抗18株Fonsecaea monophora的體外藥敏試驗(yàn)顯示：單用藥時(shí)特比萘芬MICs范圍0.0313-0.5 μg／ml，MIC90和M

14、IC50分別是0.25 μg／ml和0.125 μg／ml；伊曲康唑MICs范圍0.008-0.125 μg／ml，MIC90和MIC50分別是0.0625 μg／ml和0.0313 μg／ml；聯(lián)用藥時(shí)特比萘芬MICs范圍0.008—0.0313 μg／ml，MIC90和MIC50分別是0.0313 μg／ml和0.01565μg／ml；伊曲康唑MICs范圍0.004-0.01565 μg／ml，MIC90和MIC50分別是0.008

15、 μg／ml和0.004 μg／ml；特比萘芬的MIC幾何均數(shù)較單用藥時(shí)顯著減少(從0.116減至0.018；p<0.001)；伊曲康唑的MIC幾何均數(shù)較單用藥時(shí)顯著減少(從0.034減至0.006；p<0.001)，其差異有顯著性。 3.18株中12株(67％)其FICI值<0.5，證實(shí)有協(xié)同作用；4株(22％)FICI>0.5且FICI<1.0，證實(shí)有相加作用；2株(11％)FICI>1.0且FICI<4.0，證實(shí)有無關(guān)作用

16、；未觀察到拮抗作用。 4.5例患者接受特比萘芬和／或伊曲康唑治療，4例治愈，1例改善。其中4例資料完整，本研究就其臨床表現(xiàn)、診斷及治療方案做病例報(bào)道。 五、結(jié)論 1.首次對特比萘芬、伊曲康唑聯(lián)合治療Fonsecaea monophora所致著色芽生病進(jìn)行體外藥效評價(jià)。 2.18株中12株(67％)證實(shí)有協(xié)同作用；未觀察到拮抗作用。聯(lián)合用藥獲得的MICs遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于特比萘芬、伊曲康唑在血漿中所能達(dá)到的濃度峰值。