抗人肺癌單克隆抗體3D3的人源化及分子小型化研究.pdf

1、本文對(duì)鼠抗人肺癌單克隆抗體mAb3D3進(jìn)行了人源化和分子小型化改造。 采用CDR移植技術(shù)對(duì)mAb3D3的重鏈可變區(qū)進(jìn)行人源化。設(shè)計(jì)并通過(guò)重疊PCR技術(shù)構(gòu)建出hu3D3VH單域抗體基因。為了提高h(yuǎn)u3D3VH的功能性親和力，通過(guò)重組PCR技術(shù)分別將SV5-Cys基因和p53四聚化結(jié)構(gòu)域基因與hu3D3VH基因融合，得到同源二聚體dihu3D3VH和四聚體tehu3D3VH基因。分別構(gòu)建pET-22b(+)/hu3D3VH、pET-

2、22b(+)/dihu3D3VH和pET-22b(+)/tehu3D3VH表達(dá)載體，并在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)。它們的表達(dá)產(chǎn)物均主要以包涵體的形式存在，且表達(dá)量均占菌體總蛋白的30％以上。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+親和層析柱純化后，目的蛋白的純度均在95％以上。 間接ELISA結(jié)果證實(shí)，單域抗體hu3D3VH的抗原反應(yīng)性和特異性與3D3VH基本相同。競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果證實(shí)，hu3D3VH保留了單域抗體3D3VH的抗原表位特

3、異性。流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果顯示，與3D3VH相比，hu3D3VH的抗原結(jié)合能力下降了約29％；而與hu3D3VH相比，dihu3D3VH和tehu3D3VH與靶抗原的結(jié)合能力分別提高了約60％和160％。 成功建立了人源化單域抗體hu3D3VH的高效原核表達(dá)系統(tǒng)，制備的hu3D3VH保留了親本抗體的抗原反應(yīng)性和特異性，并通過(guò)基因工程技術(shù)獲得了功能性親和力得到優(yōu)化的hu3D3VH的同源二聚體和四聚體。這些研究工作為進(jìn)一步的體內(nèi)外生