金錢松內(nèi)生真菌殺螺活性研究.pdf

1、金錢松Pseudolarix kaempferi Gord.為我國特有單屬種、孑遺植物，目前，處于瀕危狀態(tài)，被列為國家二級保護植物，是傳統(tǒng)中藥，含有二萜類、三萜類、三萜內(nèi)酯及甾醇類等成份，具有強烈的抗真菌、抗腫瘤作用。
　　 植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生大量新的天然產(chǎn)物，有些內(nèi)生真菌還可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的代謝產(chǎn)物，已成為天然產(chǎn)物潛在的重要資源。本文以江蘇大學生藥學研究所保存的18株具有抑菌，殺菌活性的金錢松內(nèi)生真菌為研究對象，按

2、照WHO的室內(nèi)篩選殺螺藥物標準方法，尋找出對釘螺有致死作用的內(nèi)生真菌；同時也研究了金錢松原植物的殺螺活性。金錢松內(nèi)生真菌JJ18具有顯著的殺釘螺活性，對其進行了殺螺活性物質(zhì)與菌株鑒定、水生生物毒性，培養(yǎng)基條件的優(yōu)化等相關(guān)研究。本研究旨在探索從金錢松內(nèi)生真菌與原植物中發(fā)現(xiàn)殺螺活性成分的可能性，為研究新的天然產(chǎn)物殺螺藥物提供思路。主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.從金錢松的18株內(nèi)生真菌中篩選出了對釘螺有致死作用的菌株。按照WHO的殺螺

3、劑浸泡試驗法觀察內(nèi)生真菌發(fā)酵液殺螺效。其中JJ18菌株發(fā)酵液調(diào)節(jié)中和液(pH=7)有較高的殺螺效果，24h達26.7％，48h達76.7％，72h達100.0％。JJ18菌株發(fā)酵液濃度為5％時，殺螺率為53.3％，濃度10％時，殺螺率為86.7％，且對魚無急性毒性。
　　 2.研究了金錢松內(nèi)生真菌JJ18的殺螺作用、活性部位及該菌株殺螺活性的傳代穩(wěn)定性，從而探索其應用的可能性。JJ18菌株發(fā)酵液的活性成分集中在胞外液，當胞外液濃

4、度10％時，72h殺螺率接近90％，且發(fā)酵外液成鹽后有良好的耐熱性，強光照下7天內(nèi)活性物質(zhì)基本不改變，菌株傳代穩(wěn)定，殺螺活性成分集中在正丁醇萃取部位，通過ELISA鑒定JJ18發(fā)酵液乙醇提取物中含有真菌毒素赭曲霉素A(OTA)。
　　 3.研究了JJ18發(fā)酵液醇提物殺螺活性和對湖北釘螺糖原和總蛋白的生理生化影響。觀察不同濃度下JJ18發(fā)酵液提取物滅螺效果，采用葸酮顯色法測定處理后釘螺軟體的糖原含量變化，凱氏定氮法測定其蛋白質(zhì)含量

5、。結(jié)果JJ18菌株發(fā)酵液醇提物滅螺效果顯著，試驗濃度400mg/L作用3天后滅螺率達到100％，與1mg/L氯硝柳胺溶液處理2～3d的滅螺效果相當；經(jīng)統(tǒng)計分析：72h滅螺的LC50和LC90濃度分別是145.0mg/L和311.9mg/L。JJ18發(fā)酵液提取物處理后釘螺軟體的糖原含量顯著下降，減少幅度從10.42％到28.03％：蛋白質(zhì)含量的變化不明顯。
　　 4.對JJ18進行了菌株鑒定。采用形態(tài)學與分子生物學相結(jié)合的方法。通

6、過形態(tài)學鑒定判斷JJ18屬于曲霉屬。經(jīng)核糖體rDNA ITS區(qū)序列分析，JJ18與黑曲霉(Aspergillus niger)屬中的各菌株具有極高的同源性(＞96％)，從基于rDNA-ITS部分序列重建的系統(tǒng)進化樹可以看出，同屬的rDNA-ITS序列被聚在一個分支中，通過核糖體rDNA ITS區(qū)測序發(fā)現(xiàn)，該菌株序列與屬于Aspergillusniger的多條序列相似程度較高，且差異均在ITS1和ITS2區(qū)，屬于可變區(qū)。據(jù)此我們鑒定該菌株

7、屬于黑曲霉(Aspergillus niger)，GenBank登錄號為：EF660198。
　　 5.國內(nèi)首次運用了鹵蟲模型評價殺螺藥物的水生生物毒性。內(nèi)生真菌JJ18醇提物具有顯著的殺蟲活性，24h后，50mg/L、100mg/L和200mg/L殺蟲率分別達到82.2％，80.7％和96.5％。48h后，高于50mg/L殺蟲率均可達到100.0％。24h時LC50:18.37mg/L(95％置信區(qū)間4.65-43.02mg/

8、L)可知其對敏感的水生生物具有毒性。
　　 6.通過改進發(fā)酵工藝提高了金錢松內(nèi)生真菌JJ18的殺螺活性。采用單因素和正交試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化。按照WHO的殺螺劑浸泡試驗法，以殺螺率為主要優(yōu)化指標，同時考察發(fā)酵液的生物量，對金錢松內(nèi)生真菌JJ18發(fā)酵條件進行優(yōu)化。以馬鈴薯175g/L氮源，初始pH6.0，葡萄糖和蔗糖15g/L為碳源，磷酸二氫鉀0.5mmol/L為代謝調(diào)節(jié)因子，接種量2％，250mL三角瓶裝液量50m