髖臼發(fā)育不良軟骨退行性變可逆性的實驗研究.pdf

1、[背景]
　　髖臼發(fā)育不良(Acetabular Dysplasia,AD)遠期可能發(fā)生關(guān)節(jié)退行性變,并最終進展為骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA),需要進行髖關(guān)節(jié)置換術(shù),給患者帶來巨大的經(jīng)濟負擔和軀體痛苦。能否延緩或防止骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生是髖臼發(fā)育不良治療中迫切需要解決的問題。但是,目前對于髖臼發(fā)育不良向骨關(guān)節(jié)炎的演變機制還不十分清楚。既往研究表明,骨關(guān)節(jié)炎的主要病理變化是關(guān)節(jié)軟骨的退行性變,而髖臼發(fā)育不良中關(guān)節(jié)軟骨的組

2、織形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究尚少,尤其是發(fā)育中的髖臼軟骨發(fā)生退變后有無恢復(fù)的可能,恢復(fù)發(fā)生在什么時候,能恢復(fù)到什么程度等問題文獻尚未見報道。本研究擬通過施加力學(xué)改變建立不同時段的幼兔髖臼發(fā)育不良模型,并對部分模型去力學(xué)改變待其成兔,觀察髖臼軟骨的厚度、纖維化、超微結(jié)構(gòu)、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、整合素β1等的變化趨勢,分析髖臼軟骨的病理改變有何種規(guī)律并探討其可逆性,進一步揭示髖臼發(fā)育不良向骨關(guān)節(jié)炎的演變機制,為小兒髖臼發(fā)育不良最佳治療時間的選擇提

3、供理論依據(jù)。
　　[方法]
　　一不同時段髖臼發(fā)育不良兔模型的建立、影像學(xué)和組織形態(tài)學(xué)觀察
　　1.選取普通級4～5周齡新西蘭大白兔30只,隨機分為A、B、C三組,每組10只。左后肢作為實驗側(cè),分別以管型石膏外固定保持伸膝屈髖2周、4周、6周;右后肢為對照側(cè),不做處理。每組在達到各自固定時間后隨機選取5只取材,構(gòu)成幼兔組;另外5只拆除石膏繼續(xù)喂養(yǎng)至6月齡同時取材,構(gòu)成成兔組。
　　2.幼兔在石膏固定前、固定后每2

4、周拍攝X線骨盆片各1次:成兔在取材前再攝片1次。測量髖臼指數(shù)(Acetabular Index,AI)、臼頭指數(shù)(AcetabularHead Index,AHI)和Sharp角。
　　3.麻醉下取雙側(cè)全層髖臼軟骨標本,每一標本根據(jù)解剖位置分為髂骨部、恥骨部和坐骨部三部分。髂骨部用于HE染色和電鏡檢測,恥骨部和坐骨部用于PCR和Western-blot檢測。根據(jù)各實驗技術(shù)要求,標本采用不同的固定和保存方法。常規(guī)HE染色后光鏡下測量

5、軟骨厚度,觀察軟骨纖維化。
　　4.掃描電鏡觀察軟骨表面膠原纖維形態(tài);透射電鏡觀察軟骨細胞的壞死情況及胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　二Ⅰ型、Ⅱ型膠原和整合素β1在髖臼發(fā)育不良兔模型髖臼軟骨中的表達
　　1.髖臼軟骨標本采集見第一部分。
　　2.實時熒光定量PCR檢測Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、整合素β1 mRNA的定量表達。
　　3.免疫組織化學(xué)SP法檢測Ⅰ型膠原及整合素β1蛋白的定性表達。
　　4.Wester

6、n-blot檢測Ⅰ型膠原及整合素β1蛋白的定量表達。
　　[結(jié)果]
　　一不同時段髖臼發(fā)育不良兔模型的建立、影像學(xué)和組織形態(tài)學(xué)觀察
　　1.實驗兔死亡共9只,追加樣本6只,成活率75％。最后樣本量為27,幼兔每組5只;成兔A組4只、B組3只、C組1只,拆除石膏后實驗側(cè)1-5天內(nèi)恢復(fù)到自然的屈膝屈髖位;余4只拆除石膏后實驗側(cè)仍保持在伸膝屈髖位,構(gòu)成成兔D組。
　　2.幼兔中,固定2、4、6周時實驗側(cè)AI逐漸上升,與

7、固定前相比有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05),均明顯大于各自的對照側(cè)(p＜0.01);AHI逐漸下降,與對照側(cè)相比有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)。成兔中,A、B兩組實驗側(cè)AHI、Sharp角與對照側(cè)差別無統(tǒng)計學(xué)意義。C組實驗側(cè)AHI較對照側(cè)小,Sharp角比對照側(cè)大。D組實驗側(cè)AHI比對照側(cè)降低(p＜0.05);Sharp角比對照側(cè)升高(p＜0.01),較A組實驗側(cè)也升高(p＜0.05)。
　　3.幼兔中,各組實驗側(cè)髖臼軟骨外緣比對照側(cè)增

8、厚,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,A組(p=0.019)、B組(p=0.025)、C組(p＜0.001)。成兔中,各組實驗側(cè)和對照側(cè)厚度無明顯差別;實驗側(cè)髖臼軟骨外緣發(fā)生纖維化,A組1例、B組2例、C組1例、D組4例,后者與對照側(cè)相比有統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.014)。
　　4.掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)幼兔A組實驗側(cè)髖臼軟骨表面膠原纖維明顯較對照側(cè)粗大;B、C兩組制片不理想。透射電鏡結(jié)果示A組對照側(cè)軟骨分為4層,各層細胞形態(tài)良好,表面纖維致密;實驗側(cè)第

9、2、3、4層均可見到大量壞死軟骨細胞;B、C兩組壞死軟骨細胞數(shù)較A組少。成兔中,A組實驗側(cè)未見明顯異常;B組實驗側(cè)髖臼軟骨細胞內(nèi)脂滴增多,溶酶體小體增多。
　　二Ⅰ型、Ⅱ型膠原和整合素β1在髖臼發(fā)育不良兔模型髖臼軟骨中的表達
　　1.Ⅰ型膠原:免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗側(cè)和對照側(cè)髖臼軟骨中均有Ⅰ型膠原的表達。實時熒光定量PCR示mRNA表達成兔較幼兔升高,成兔D組實驗側(cè)比對照側(cè)降低(p＜0.05)。Western-blot

10、示Ⅰ型膠原蛋白隨兔齡增加表達升高,實驗側(cè)的表達較對照側(cè)低。
　　2.Ⅱ型膠原:實時熒光定量PCR示實驗側(cè)和對照側(cè)間mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)差異;幼兔實驗側(cè)A組表達即有明顯上升,隨后B組下降,最后C組又上升;對照側(cè)中隨年齡增加表達不斷上升。
　　3.整合素β1:免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗側(cè)和對照側(cè)髖臼軟骨中均有整合素β1的表達。實時熒光定量PCR示實驗側(cè)和對照側(cè)間mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)差異。Western-blot結(jié)果示成兔B組實

11、驗側(cè)蛋白表達較對照側(cè)升高。
　　[結(jié)論]
　　一不同時段髖臼發(fā)育不良動物模型的影像學(xué)、組織形態(tài)學(xué)以及超微結(jié)構(gòu)的改變在一定的時間節(jié)點上具有可逆性,可能為小兒髖臼發(fā)育不良治療時點的選擇提供理論依據(jù)。
　　二髖臼發(fā)育不良中幼兔髖臼軟骨外緣厚度增加、成兔發(fā)生纖維化以及軟骨細胞超微結(jié)構(gòu)改變,可能是髖臼發(fā)育不良向骨關(guān)節(jié)炎演變的病理基礎(chǔ)。
　　三髖臼發(fā)育不良兔模型髖臼軟骨中Ⅰ型、Ⅱ型膠原表達的結(jié)果提示:這兩個膠原參與了關(guān)節(jié)軟骨