大黃魚弧菌病研究——病原生物學(xué)及免疫學(xué)研究.pdf

1、1、將副溶血弧菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用天然海水洗脫，調(diào)整菌濃度至107cells/mL左右后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行饑餓試驗。結(jié)果表明：在饑餓初期細(xì)菌總數(shù)、CFU和活菌數(shù)都有較大幅度上升；在饑餓中、后期，細(xì)菌總數(shù)、CFU和活菌數(shù)都呈下降趨勢，其中總菌數(shù)與活菌數(shù)緩慢下降，而CFU數(shù)降低速度較快。結(jié)晶紫染色觀察的結(jié)果表明：饑餓前副溶血弧菌呈短桿狀，染色均勻；饑餓后許多細(xì)胞中央出現(xiàn)染色較淺的區(qū)域，而且細(xì)胞形態(tài)也變?yōu)闄E圓形。以對數(shù)生長期的副溶血弧

2、菌為對照，對饑餓60d的副溶血弧菌進(jìn)行熱處理和紫外線處理。結(jié)果表明饑餓60d的副溶血弧菌對熱和紫外線更敏感。用間接ELISA測定饑餓前后副溶血弧菌的最低檢測限，饑餓60d的副溶血弧菌的檢測限略低于饑餓前。采用細(xì)菌計數(shù)法測定不同饑餓時期副溶血弧菌對大黃魚表皮粘液的粘附情況，結(jié)果表明溶藻弧菌對大黃魚表皮粘液的粘附量隨著饑餓時間延長而急劇下降，饑餓7d后的粘附量接近于空白。提取副溶血弧菌的全蛋白，用SDS-PAGE分析不同饑餓時期蛋白質(zhì)的差異

3、，結(jié)果表明：饑餓30d后菌蛋白質(zhì)條帶比饑餓前的蛋白質(zhì)條帶少；饑餓60d后蛋白質(zhì)條帶比饑餓30d后菌蛋白質(zhì)條帶又有所增加，但比饑餓前少。 2、采用熒光標(biāo)記計數(shù)法測定溶藻弧菌的粘附作用。結(jié)果表明溶藻弧菌對大黃魚腸粘液的粘附量隨菌濃度的升高而升高并在1～1.5h內(nèi)趨于飽和；粘附作用在溫度15～30℃、pH偏酸時較強(qiáng)；鹽度在5～35范圍內(nèi)對前腸粘液的粘附作用影響不明顯，后腸粘液的粘附作用在此范圍內(nèi)隨鹽度增大而加強(qiáng)，在鹽度為0時，溶藻弧菌

4、對前、后腸粘液都無粘附作用；56℃熱處理5min及60℃處理1h均能大幅減弱溶藻弧菌對兩種腸粘液的粘附作用，表明溶藻弧菌表面的某些熱敏結(jié)構(gòu)在粘附作用中起著重要作用。根據(jù)以上結(jié)果可以認(rèn)為溶藻弧菌能夠很好地粘附于大黃魚腸粘液層，其粘附作用受溫度、鹽度、pH值等環(huán)境因子影響很大，溶藻弧菌表面的某些熱敏結(jié)構(gòu)可能在粘附過程中起著重要作用。 3、采用3H-TdR同位素示蹤方法研究了環(huán)境因子對溶藻弧菌對大黃魚表皮粘液粘附作用的影響。試驗結(jié)果表

5、明溶藻弧菌能很好地粘附于大黃魚表皮粘液，其粘附量在菌濃度不超過6.52×108cfu/ml情況下隨菌濃度的升高而升高；粘附量在25℃下孵育180min趨于飽和，在180min以內(nèi)與孵育時間呈正相關(guān)關(guān)系；粘附作用在溫度25～30℃、pH偏酸、鹽度35條件下較強(qiáng)；在鹽度為0時，無粘附作用；Ca2+能顯著加強(qiáng)溶藻弧菌的粘附作用，而Mg2+作用不明顯；溶藻弧菌經(jīng)營養(yǎng)饑餓、熱處理、抗體處理、蛋白酶及高碘酸處理后粘附作用有明顯下降；在8種碳水化合物

6、的干擾下溶藻弧菌的粘附作用會有一定程度的變化，其中葡萄糖、果糖、甘露糖能明顯促進(jìn)溶藻弧菌的粘附作用；溶藻弧菌對大黃魚表皮粘液中較大分子量的物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力。這些結(jié)果表明溶藻弧菌對大黃魚表皮粘液有較強(qiáng)的粘附作用，其粘附作用受溫度、鹽度、pH等環(huán)境因子的影響，溶藻弧菌對大黃魚表皮粘液存在特異性粘附作用，這種粘附與細(xì)菌活力，其表面的蛋白類、糖類等物質(zhì)以及粘液的化學(xué)組成都有密切關(guān)系。 4、分別用飽和硫酸銨二次鹽析法和蛋白A親和層析法對

7、健康大黃魚(Pseudosciaenacrocea)血清中的免疫球蛋白(IgM)進(jìn)行分離純化，所得產(chǎn)物用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：蛋白A親和層析法可以較好地分離到高純度的大黃魚血清IgM，產(chǎn)物的電泳膠中只有重鏈和輕鏈2個條帶；飽和硫酸銨二次鹽析法除了有這2個條帶，還有很多雜帶，而且蛋白A親和層析法更為簡便、快速，因此用蛋白A親和層析法分離純化IgM優(yōu)于飽和硫酸銨二次鹽析法；大黃魚免疫球蛋白重鏈的分子量在76kDa左右；輕鏈分子

8、量在28kDa左右。用純化的大黃魚IgM免疫實驗兔，獲得效價高達(dá)1∶40960的兔抗魚IgM血清。本文所建立的蛋白A親和層析法提取大黃魚血清IgM可以方便、快捷地獲得高純度的產(chǎn)物，適合在實驗室中純化魚類IgM。 5、用濃度為2×106cfu/ml的溶藻弧菌通過背部肌肉注射感染大黃魚，每尾大黃魚注射0.2ml，對照組大黃魚每尾注射0.2ml滅菌生理鹽水，注射后第1天、第2天、第4天、第8天、第12天、第16天、第20天取兩組大黃魚