聚酰胺-胺與聚乙烯亞胺共聚物及其葉酸修飾的基因傳遞系統(tǒng)的構(gòu)建及性能評估.pdf

1、人類目前很多疾病用傳統(tǒng)的治療方法，手段和技術(shù)很難治愈或者難達到較好的治療效果。隨著人類基因工程計劃的完成，分子生物學(xué)及其技術(shù)的發(fā)展，人們可以從基因水平去認識疾病，發(fā)現(xiàn)致病基因，實現(xiàn)基因治療的可能?；蛑委熅褪菍⑼庠葱灾委熁蛲ㄟ^載體傳送到病變的組織或細胞，沉默非正常的基因表達，替換或者修復(fù)有缺陷的基因，從而達到治療疾病的目的。由于單純的裸基因在傳遞的過程中容易被體內(nèi)的一些生物酶降解而失去治療作用，因此基因需要載體的傳送。研究表明，載體的

2、類型往往決定基因的傳遞效率，從而決定著治療的效果。因此，發(fā)展有效的基因載體是發(fā)展基因治療的必由之路。此外，病毒載體還有制造成本高，制備復(fù)雜，基因協(xié)載量低等問題?；谶@些問題，很多研究將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了非病毒基因載體的研究。非病毒載體可以克服病毒載體的安全性問題，但是其傳遞效率低于病毒載體，往往很難達到滿意的治療效果。因此，發(fā)展高效的，高安全性的非病毒載體用于基因治療非常必要。其中，陽離子聚合物聚酰胺-胺(polyamidoamine，PAMA

3、M)和聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是兩類研究比較多的非病毒基因載體。一般地，高代數(shù)的PAMAM和大分子量的PEI都具有高的轉(zhuǎn)染效率，但是伴隨著很大的細胞毒性;相反，低代數(shù)的PAMAM和小分子量的PEI具有很低的細胞毒性，但伴隨著很低的轉(zhuǎn)染效率，而且這兩類載體的抗血清能力非常的差，用于臨床試驗具有很大的挑戰(zhàn)。
　　另一方面，載體要用于體內(nèi)基因治療必須具有一定的穩(wěn)定性和靶向能力。聚乙二醇化(PEGylatio

4、n)常常被用來提高載體的穩(wěn)定性，降低載體與體內(nèi)陰離子型物質(zhì)的非特異性結(jié)合，延長體內(nèi)循環(huán)時間。另外，PEG還常用作配體和載體的連接劑，既可以保持PEG的優(yōu)點，同時還可以增加配體-受體結(jié)合的能力。雖然這樣的策略在一定程度上提高了系統(tǒng)的膠束穩(wěn)定性和細胞特異性，但是PEG的修飾同樣存在一些問題，主要是:降低載體的細胞攝取和溶酶體中逃逸的能力。因此，本研究的重要之二是:構(gòu)建PEG-配體修飾的PAMAM-PEI靶向基因傳遞系統(tǒng)，然后嘗試通過優(yōu)化PE

5、G末端配體密度去克服PEG作用降低的細胞攝取和進一步提高載體的轉(zhuǎn)染活力和細胞特異性。
　　根據(jù)上面的敘述，我們將論文分成2個部分，第一部分是合成PAMAM-PEI共聚物，對其轉(zhuǎn)染活力和細胞毒性進行評估，初步考察它們的基因傳遞機制。第二部分工作是根據(jù)第一部分的結(jié)果去構(gòu)建一種轉(zhuǎn)染活力更高、毒性更低的PAMAM-PEI的共聚物，然后以此共聚物為基礎(chǔ)構(gòu)建葉酸靶向的基因傳遞系統(tǒng)。
　　在研究的第一部分，我們將生物兼容性好的PAMAM

6、G1.5和G2.5與毒性低的分支狀PEI1800 Da通過酰胺化反應(yīng)合成一種以PAMAM為核，PEI為外層的PAMAM-PEI(PAPE)共聚物。通過紅外，核磁，GPC對其結(jié)構(gòu)進行了表征。然后考察了PAPE對DNA的壓縮能力，復(fù)合物的抗核酸酶降解能力，并對PAPE/DNA復(fù)合物的粒經(jīng)，電位，形態(tài)進行了測定。對復(fù)合物在不同細胞系上的轉(zhuǎn)染效率，毒性進行了評估。最后對其在HEK293T細胞上的轉(zhuǎn)染機制進行了初步研究。具體的內(nèi)容如下:
　

7、　(1)以PAMAM G1.5或G2.5為核心，與過量的分支狀PEI1800通過酰胺化反應(yīng)合成PAMAM為核，PEI為外層的PAMAM-PEI共聚物。以PAMAMG1.5和G2.5為核的共聚物分別被命名為PAPE-1和PAPE-2.用紅外(FT-IR)，核磁(1H NMR)和凝膠滲透色譜(GPC)對其結(jié)構(gòu)進行表征。結(jié)果顯示，在PAPEs的紅外和核磁圖譜上沒有PAMAM G1.5和G2.5上的甲酯(-COCH3)特征峰，這是由于PAMAM

8、和PEI發(fā)生了酰胺化反應(yīng)生成了酰胺鍵導(dǎo)致其消失，且甲酯基全部參與了反應(yīng)。
　　(2)PAPEs/pDNA復(fù)合物生物理化性質(zhì)的研究。利用凝膠電泳對PAPEs的基因壓縮能力進行了評估，發(fā)現(xiàn)，PAPE-1和PAPE-2在N/P=2時可以完全阻滯DNA的遷移，能力和PEI25K相當(dāng)，但稍弱于PAMAM G5.利用核酸酶降解實驗來考察PAPE對DNA的保護能力，發(fā)現(xiàn)PAPEs在N/P=2時開始呈現(xiàn)出保護能力且隨著N/P的升高而增強。

9、　　(3)對PAPEs/DNA復(fù)合物在不同細胞系上的轉(zhuǎn)染活力分別在有無血清的條件下進行了評估。HEK293T的轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，PAPEs的轉(zhuǎn)染活力是隨著N/P的升高先提高再降低的，在無血清的條件下最優(yōu)比是N/P=25，有血清條件下的最優(yōu)轉(zhuǎn)染比是N/P=90.在N/P=25時，PAPEs的轉(zhuǎn)染活力顯著高于PEI25K，PAMAM G5，PEI1800的最優(yōu)轉(zhuǎn)染效率，但是弱于商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(P＜0.05)。<

10、br>　　(4)利用細胞途徑抑制劑來研究PAPEs/DNA進入細胞的機制，利用共聚焦顯微鏡(CLSM)來觀察復(fù)合物進入細胞后其在胞內(nèi)的分布位置，利用溶酶體突破試劑-氯喹來驗證復(fù)合物是否通過溶酶體，利用aphidicolin對細胞的分裂進行抑制研究細胞分裂對轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果表明，PAPEs/DNA復(fù)合物進入細胞主要是caveolae-mediated pathway(CvME)途徑。CLSM觀察到大部分復(fù)合物沒有與溶酶體重疊共定位在一

11、起而且接近細胞核的邊緣，這說明大部分復(fù)合物不經(jīng)過溶酶體;為了進一步證實這個現(xiàn)象，細胞轉(zhuǎn)染前用氯喹預(yù)處理以促進載體逃離溶酶體從而提高轉(zhuǎn)染效率，但是復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率不能提高，這說明復(fù)合物具有足夠的緩沖能力突破溶酶體或者復(fù)合物不經(jīng)過溶酶體。
　　在本文的第二部分，鑒于第一部分的結(jié)果PAPE高效的基因傳遞效率，這很可能歸功于它的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢，雖然研究也發(fā)現(xiàn)它們的細胞毒性雖然較PEI25K低，但是它的安全濃度范圍相對較窄，濃度在30μg/mL就

12、可以使HeLa細胞喪失～30％的細胞活力，因此我們首先研究了其結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)染效率、毒性間的關(guān)系，期望發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率更高和毒性更低的PAMAM-PEI共聚物。由于陽離子聚合物的毒性是和分子量是成正比的，所以我們采用支化的小分子PEI423去替代PEI1800與PAMAM G2.5反應(yīng)合成一種具有薄PEI外層的新型的PAMAM-PEI雜交體(PME)，然后對其毒性和轉(zhuǎn)染活力進行了評估。結(jié)果表明，PME在所測細胞系上均表現(xiàn)出比PAPE-2更高的轉(zhuǎn)染

13、效率(P＜0.05）同時也具有抗血清的能力，但同時它的細胞毒性顯著低于PAPE-2(P＜0.05)。然后，為了進一步提高PME的細胞特異性，我們用PEG，F(xiàn)A1-PEG和FA2-PEG對其進行化學(xué)修飾，合成了具有相同PEG取代度但不同葉酸密度的PME作為靶向基因載體，同時考察葉酸密度對提高PME的轉(zhuǎn)染活力和細胞特異性的影響。利用1H NMR和UV對其結(jié)構(gòu)進行了表征。它們對基因的壓縮能力，復(fù)合物的粒徑電位進行了測量，考察了它們的細胞毒性和

14、溶血性，利用流式細胞儀對其轉(zhuǎn)染效率和細胞攝取進行了測定，對其細胞攝取的機制用抑制劑進行了評估，最后比較了它們在HEK293T多細胞球體上的攝取。具體的研究內(nèi)容如下:
　　(1)PAMAM G2.5與過量的PEI423通過酰胺化反應(yīng)合成PAMAM G2.5-PEI423(PME).用FT-IR,1H NMR和GPC對其結(jié)構(gòu)進行了表征，結(jié)果表明，PME被成功合成。然后對其在多種細胞上的轉(zhuǎn)染活力進行了測定，與PAPE-2相比，PME的轉(zhuǎn)

15、染活力更高(P＜0.05)。它們對細胞的毒性大小進行析因分析后發(fā)現(xiàn)載體的類型對細胞活力有顯著影響(F=485.861，P=.000)，在每個濃度進一步單獨比較，發(fā)現(xiàn)PME的細胞活力顯著高于PAPE-2(P＜0.05)。
　　(2)利用瓊脂糖凝膠電泳對共聚物的基因壓縮能力進行了評估，結(jié)果表明PEGylation沒有顯著影響PME的基因壓縮能力，所有的共聚物在N/P=2時可以完全阻滯DNA的遷移。利用馬爾文粒徑儀對復(fù)合物的粒徑和電位進

16、行了測量。
　　(3)共聚物轉(zhuǎn)染活力的評估。對葉酸受體陽性細胞HEK293T和HeLa細胞轉(zhuǎn)染規(guī)律是:PME經(jīng)PEG化后轉(zhuǎn)染效率顯著降低（P＜0.05），當(dāng)PEG的末端連上1價FA分子后，轉(zhuǎn)染效率顯著提高(P＜0.05），當(dāng)PEG的末端連接上2價的FA分子之后，轉(zhuǎn)染效率再次提高(P＜0.05）。
　　(4)細胞攝取機制的研究。利用游離葉酸和細胞攝取通道抑制劑研究PME-(PEG3.4k-FA2)1.72，PME-(PEG3.

17、4k-FA1)1.66，PME-(PEG3.5k)1.69復(fù)合物的細胞攝取機制。葉酸受體陽性細胞經(jīng)游離葉酸預(yù)處理后，細胞表面的葉酸受體將被飽和。
　　通過本研究主要得出:1）PAPE具有很高的轉(zhuǎn)染活力和相對低的細胞毒性，復(fù)合物進入細胞主要通過小窩蛋白調(diào)控的內(nèi)吞作用，此途徑可以減少復(fù)合物進入溶酶體的量避免被降解，細胞分裂時的核運輸，基因表達的規(guī)律近似符合玻爾茲曼模型函數(shù);2）利用小分子PEI423替代PEI1800與PAMAM G2