2810430M08Rik基因的組織特異性表達(dá)及在T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)中的作用.pdf

1、2810430M08Rik是近年來小鼠基因組研究中新發(fā)現(xiàn)的一個分布和功能未知的基因.2810430M08Rik的eDNA序列與其他己知基因沒有任何顯著的同源性,它所編碼的約281氨基酸長的蛋白質(zhì),也不含有任何己證實功能的結(jié)構(gòu)域.目前為止,還沒有任何有關(guān)此基因產(chǎn)物分布或功能的報道.在對T淋巴細(xì)胞活化機(jī)制的前期研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞發(fā)生活化后2810430M08Rik基因的表達(dá)可發(fā)生上調(diào),提示此新基因可能參與T淋巴細(xì)胞的活化,并與T淋巴細(xì)胞免疫

2、反應(yīng)中的某些功能有關(guān).本課題以2810430M08Rik基因產(chǎn)物在小鼠組織中的特異性分布以及在T淋巴細(xì)胞發(fā)育、活化和相關(guān)免疫反應(yīng)中的作用為主要研究對象,力求揭開此未知基因的神秘面紗. 第一部分：281043OM08Rik基因的組織特異性表達(dá)及在T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)中的作用 目的： (1)驗證2810430M08Rik基因在T淋巴細(xì)胞活化過程中的表達(dá)變化. (2)觀察2810430M08R8ik基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在

3、C57BL/6J小鼠個體發(fā)育過程中的表達(dá)模式,分析其在小鼠胚胎期、新生期及成年期各階段的組織和細(xì)胞特異性分布特征. (3)評估2810430M08Rik基因的高表達(dá)是否影響小鼠主要系統(tǒng)的一般情況. (4)評估并分析2810430M08Rik基因的高表達(dá)對T淋巴細(xì)胞發(fā)育、活化和T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的相關(guān)方面是否存在影響,并探討可能的機(jī)制. 方法： (1)Nonhem blot測定2810430M08Rik m

4、RNA的表達(dá)水平. (2) In situ hybridization 分析 2810430M08Rik mRNA 的分布情況. (3) 構(gòu)建2810430M08Rik重組質(zhì)粒,使用顯微注射技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因小鼠,并用 Southern blot、PCR 及 Real-time RT-PCR進(jìn)行鑒定. (4) 大體水平觀察轉(zhuǎn)基因鼠外觀和活動、飲食和排泄、生物節(jié)律和繁殖,以及主要臟器外觀和重量等一般情況. (5

5、) 使用同位素[<'3>H]標(biāo)記的胸腺嘧啶攝取率測定、流式細(xì)胞學(xué)測定、ELISA、化學(xué)趨化實驗、遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型等分別測定轉(zhuǎn)基因小鼠T淋巴細(xì)胞發(fā)育、活化的情況和其體內(nèi)外功能的主要方面,評估T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)性. 結(jié)論： (1) 2810430M08Rik 基因在小鼠個體發(fā)育過程中具有獨特的組織特異性表達(dá)模式,這是今后深入研究不可缺少的重要工具. (2) 2810430M08Rik 基因在 T 淋巴細(xì)胞活化時發(fā)生

6、表達(dá)上調(diào),但目的基因的高表達(dá)并不能顯著影響T淋巴細(xì)胞的發(fā)育、活化和T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng). (3) 2810430M08Rik 基因?qū)γ庖呦到y(tǒng)的其他方面,或在其他系統(tǒng)和組織中的發(fā)育和功能,以及在病理條件下的作用還有待進(jìn)一步深入探索.蛋白酶體作為真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的核心場所,承擔(dān)著細(xì)胞內(nèi)80～90﹪蛋白質(zhì)的降解,對維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和調(diào)控細(xì)胞生長代謝具有重要的意義.蛋白酶體抑制劑是一系列小分子化合物,能通過多種途徑選擇性的抑制蛋白酶體的

7、水解活性,并因其顯著的抗腫瘤作用而廣收關(guān)注.越來越多的實驗資料表明,蛋白酶體抑制劑除能作用于惡性組織細(xì)胞外,還能影響正常組織細(xì)胞的多種生理病理過程. Ps-341是首支應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療的硼肽類蛋白酶體抑制劑,本篇研究觀察PS-341對心肌和血管平滑肌組織蛋白酶體活性的作用,并主要探討其對平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,為探索蛋白酶體抑制劑應(yīng)用于心血管病防治打下初步的理論基礎(chǔ),具一定的臨床指導(dǎo)意義. 第二部分:蛋白酶體抑制劑

8、--PS-341能有效抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡 目的： (1)觀察PS-341對心肌和血管平滑肌組織特異性蛋白酶體活性的抑制效果. (2)觀察PS-341對離體培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞增殖率的影響. (3)觀察PS-341對離體培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞凋亡率的影響,并對作用機(jī)制進(jìn)行初步研究. (4)觀察PS-341對由TNF-α引起的平滑肌細(xì)胞NF-кB活化的影響. 方法： (1)分別

9、提取C57BL/6J小鼠的新鮮心肌和主動脈中層組織,觀察蛋白粗體物對底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC的水解能力,評估蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性. (2)提取小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),通過[<'3>H]標(biāo)記的胸腺嘧啶攝取率實驗測定平滑肌細(xì)胞的增殖水平. (3)采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)測定主動脈平滑肌細(xì)胞凋亡的水平,并用實時定量熒光RT-PCR和Western印跡分析某些促/抗凋亡因子的含量變化.

10、(4)采用Western印跡觀察平滑肌細(xì)胞胞漿IκB-α和核內(nèi)NF-κB水平變化. 結(jié)論： 在心血管系統(tǒng),PS-341能有效抑制心肌和血管平滑肌蛋白酶體的水解活性,在低濃度下能劑量依賴性的抑制平滑肌細(xì)胞增殖,并在稍高濃度時促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡.在細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn),雖然PS-341能下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL和Flip的基因轉(zhuǎn)錄的水平,但對效應(yīng)蛋白的含量并無顯著影響,同時對NF-κB的活化轉(zhuǎn)位也無明顯抑制