慢性鼻竇炎和鼻息肉中miRNAs的差異性表達及其意義.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：慢性鼻竇炎和鼻息肉中miRNAs的差異性表達研究
　　 背景：慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)和鼻息肉(nasal polyps，NP)是鼻腔鼻竇的慢性炎癥性疾病，它的發(fā)病機制尚未完全闡明。MicroRNA(miRNA)已被證明廣泛參與免疫反應(yīng)。我們對慢性鼻竇炎伴和鼻息肉及正常人群的miRNA(miR)進行差異性表達的研究，篩選出部分miRNA，驗證表

2、達的差異性。
　　 方法：采用miRNA 芯片(miRNA array)方法對慢性鼻竇炎，鼻息肉和正常鼻粘膜miRNA的表達譜進行了檢測分析。根據(jù)文獻報道，篩選出miR-125b和miR-26a，用實時定量（real-time）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR）和原位雜交進一步驗證芯片結(jié)果。
　　 結(jié)果：慢性鼻竇炎組中，有4種m

3、iRNAs表達上調(diào)，23種miRNAs表達下調(diào)；鼻息肉組織中，有7種miRNAs表達上調(diào)，69種miRNAs表達下調(diào)。實時定量RT-PCR顯示miR-125b 鼻息肉表達升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-125b 在BEAS-2B細胞上存在表達，miR-26a 在BEAS-2B細胞無表達。miR-125b 在人體鼻息肉組織的上皮表達上調(diào)。
　　 結(jié)論：miRNA 在慢性鼻竇炎和鼻息肉的表達存在差異。miR-125b

4、在鼻息肉中表達明顯上調(diào)，可能與鼻息肉的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究其調(diào)控方式，可為進一步探索鼻息肉的發(fā)病機制提供線索。
　　 第二部分：miR-125b表達上調(diào)在鼻息肉發(fā)病機制中的意義
　　 背景：miR-125b 已被證明在鼻息肉表達增強。用生物信息學(xué)方法預(yù)測出4EBP1的3’非編碼區(qū)與miR-125b 有互補系列。4EBP1 通過對I型IFN信號通路有調(diào)控作用。我們對4EBP1是否為miR-125b的直接靶點進行驗證，并對mi

5、R-125b是否通過調(diào)控4EBP1 在鼻息肉發(fā)病中發(fā)揮作用進行了探討。
　　 方法：采用免疫組織化學(xué)方法檢測4EBP1 在慢性鼻竇炎及鼻息肉中的表達情況。將miR-125b的mimic 及inhibitor轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞，24 小時后采用免疫印跡法(Western blot)檢測4EBP1 蛋白質(zhì)表達水平；構(gòu)建將4EBP1 3’UTR的部分序列嵌入pGL3 質(zhì)粒，以構(gòu)建pGL3-4EBP1 質(zhì)粒；重組質(zhì)粒與miR-125

6、b的mimic 共轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞，檢測熒光素酶吸光度；實時定量RT-PCR 用于檢測慢性鼻竇炎及鼻息肉中IFN-β和IL-5 mRNA的表達水平有無差異，對IFN-β和IL-5 mRNA表達水平進行相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果：免疫組化發(fā)現(xiàn)與正常對照比較，4EBP1 蛋白質(zhì)水平在鼻息肉出現(xiàn)下調(diào)；體外實驗發(fā)現(xiàn)，分別上調(diào)和下調(diào)miR-125b 水平后，4EBP1 蛋白水平相應(yīng)出現(xiàn)下降和升高。熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染重組有m

7、iR-125b 互補結(jié)合序列的質(zhì)粒和miR-125b mimic后，熒光素強度明顯降低，提示miR-125b 能抑制4EBP1的表達。實時定量RT-PCR 顯示與對照組相比，IFN-β和IL-5 mRNA 在鼻息肉表達增強，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。慢性鼻竇炎及鼻息肉中IFN-β和IL-5 mRNA 水平呈負相關(guān)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：4EBP1是miR-125b的直接靶向調(diào)控分子。miR-125b 通過介導(dǎo)4EB