Irf1基因在伴有高血壓的糖尿病大鼠大血管病變VSMC增殖中的作用.pdf

1、研究Irfl基因高表達(dá)對(duì)高糖條件培養(yǎng)下的伴有高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖的影響，探討Irfl基因在伴有高血壓的糖尿病大鼠大血管病變VSMC增殖中的作用及機(jī)制，對(duì)于糖尿病血管并發(fā)癥的防治具有重要意義。本研究采用體外培養(yǎng)SHR和SD大鼠的VSMC的技術(shù)，建立了Irfl基因的高表達(dá)模型。運(yùn)用PCR等方法克隆Irfl基因的編碼序列，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-Irfl的真核表達(dá)載體。通過繪制轉(zhuǎn)染后的VSMC生長曲線、MTT比色法、

2、PCNA免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變，發(fā)現(xiàn)Irfl基因增強(qiáng)了DNA的合成并且加速了VSMC細(xì)胞周期的進(jìn)程，對(duì)VSMC的增殖有明顯的促進(jìn)作用。結(jié)合我室前期工作，初步證明了Irfl基因在伴有高血壓的糖尿病大鼠大血管病變VSMC增殖中起重要的作用。 目的：研究Irfl基因高表達(dá)對(duì)高糖條件培養(yǎng)下的SHR VSMC增殖的影響，探討Irfl基因在伴有高血壓的糖尿病大鼠大血管病變VSMC增殖中的作用及機(jī)制。

3、 材料與方法：①體外采用植塊法培養(yǎng)SHR和SD大鼠的VSMC，并利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法鑒定，建立后續(xù)研究的細(xì)胞模型。②采用PCR等方法克隆Irfl基因的編碼序列，并在此基礎(chǔ)上將該序列連接到pcDNA3.1質(zhì)粒中，構(gòu)建pcDNA3.1-Irfl的真核表達(dá)載體，為后續(xù)高表達(dá)細(xì)胞模型的建立及其在VSMC增殖中的作用研究奠定基礎(chǔ)。③以SHR轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NON組為對(duì)照，將DcDNA3.1-Irfl轉(zhuǎn)染入SHR和SD大鼠的VSMC中，

4、高糖培養(yǎng)，建立Irfl基因高表達(dá)細(xì)胞模型。通過繪制轉(zhuǎn)染后的VSMC生長曲線、MTT比色法、PCNA免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變。 結(jié)果：①體外獲得純度較高的SHR和SD大鼠的VSMC，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定a-actin陽性，細(xì)胞經(jīng)過凍存后可以成功的復(fù)蘇，細(xì)胞活力未受明顯影響。②從大鼠肝臟中提取了完整的總RNA，并利用了PCR的方法正確擴(kuò)增出了Irfl基因的蛋白編碼序列片斷。在此基礎(chǔ)之上，將擴(kuò)增出的基因連接到

5、了pcDNA3.1真核表達(dá)載體中，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-Irfl的真核表達(dá)載體。對(duì)構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果片斷長短與預(yù)期一致。最后對(duì)構(gòu)建好的真核表達(dá)載體進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列100％相符，序列插入方向正確，根據(jù)該測(cè)序結(jié)果可以判定該質(zhì)粒為成功構(gòu)建的pcDNA3.1-Irfl重組質(zhì)粒。③建立了Irfl基因的高表達(dá)模型，轉(zhuǎn)染后VSMC增殖能力呈明顯上升趨勢(shì)；PCNA免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示Irfl基因轉(zhuǎn)染后(SH

6、R、SD大鼠)細(xì)胞PCNA表達(dá)高于SHR轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NON組(p<0.05)。生長曲線顯示Irfl基因轉(zhuǎn)染后VSMC生長擴(kuò)增明顯高于SHR轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組。MTT比色法顯示，Irfl轉(zhuǎn)染組(SHR VSMC、SD VSMC)活細(xì)胞數(shù)量顯著高于pcDNA3.1-NON組(P<0.01)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Irfl的VSMC細(xì)胞周期發(fā)生明顯的改變，SHR轉(zhuǎn)染Irfl基因組VSMC居于DNA合成期(S期)的細(xì)胞數(shù)量明顯高

7、于SD大鼠轉(zhuǎn)染Irfl基因組和SHR轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NON組(P<0.001)。SHR轉(zhuǎn)染pc：DNA3.1-Irfl組的S期細(xì)胞數(shù)量多，表明該基因增強(qiáng)了DNA的合成并且加速了VSMC細(xì)胞周期的進(jìn)程，對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯的作用。 結(jié)論：①SHR和SD大鼠的原代培養(yǎng)成功，可以傳代擴(kuò)增和凍存復(fù)蘇，并且鑒定為高純度的平滑肌細(xì)胞。②成功構(gòu)建了pcDNA3.1-Irfl的真核表達(dá)載體。③Irfl基因在伴有高血壓的糖尿病大鼠大血管病變V