牛筋草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其抗百草枯的研究.pdf

1、牛筋草（Eleusine indicaL.）是禾本科雜草，已成為世界十大惡性雜草之一。由于百草枯的長(zhǎng)期使用，使得牛筋草對(duì)其產(chǎn)生了抗藥性。本試驗(yàn)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，初步建立了牛筋草遺傳轉(zhuǎn)化體系；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，分析了PqE、PqTS1、PqTS2和PqTS3基因在牛筋草抗百草枯機(jī)制中的表達(dá)差異；通過(guò)高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，研究了內(nèi)源多胺在牛筋草抗百草枯機(jī)制中的作用；同時(shí)，揭示了PqE、PqTS1、PqTS

2、2和 PqTS3基因差異表達(dá)在內(nèi)源多胺代謝和牛筋草對(duì)百草枯抗性的作用機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　1、以敏感型牛筋草種子為外植體，分別對(duì)種子處理、愈傷組織誘導(dǎo)和分化條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明：牛筋草種子于-20℃儲(chǔ)存20～30 d是解除種子休眠的最佳方法；0.05％氯化汞浸泡10 min是牛筋草種子消毒滅菌的最適濃度和最佳時(shí)間；最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基：N6基本培養(yǎng)基+0.5mg·L-12,4-D+0.5 g·L-1脯氨酸+0.6g·L-1水

3、解酪蛋白+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+3 g·L-1植物凝膠，誘導(dǎo)率最高可達(dá)75%；最佳分化培養(yǎng)基激素配比為0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+0.05 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1IAA，分化率高達(dá)100%。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了與2,4-D濃度相關(guān)的一類新型愈傷組織，提高了愈傷組織誘導(dǎo)率、改善了愈傷質(zhì)量、縮短了再生周期，為遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　2、抗性篩選培養(yǎng)基中潮霉素濃度

4、以30 mg·L-1為宜，羧芐青霉素濃度以300 mg·L-1為宜；最佳的遺傳轉(zhuǎn)化條件為：OD600為0.5，抽真空，侵染30 min，共培養(yǎng)3 d，AS濃度以300μmol·L-1為宜。轉(zhuǎn)化后的叢生芽經(jīng)生根篩選、GUS染色和PCR擴(kuò)增，最終獲得了6株陽(yáng)性苗。
　　3、qRT-PCR結(jié)果顯示，在噴施百草枯后30～90min，PqE、PqTS1、PqTS2和PqTS3基因的表達(dá)有差異；抗性型牛筋草較敏感型牛筋草，PqE基因表達(dá)量相對(duì)

5、下調(diào)，在90min明顯上調(diào)，且同步于PqTS2基因和PqTS3；百草枯處理后，抗性型牛筋草中PqTS1基因上調(diào)，且在90min高表達(dá)，敏感型牛筋草中噴施百草枯無(wú)明顯變化。
　　4、HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示：（1）噴施百草枯后的不同時(shí)間段內(nèi)，R型和S型牛筋草中腐胺（PUT）變化不明顯，推測(cè)PUT在緩解百草枯毒性中的作用不大。（2）噴施百草枯后0～60 min，R型牛筋草中亞精胺（SPD）含量顯著上升了400倍，90 min時(shí)SPD含量突