青蒿素衍生物治療腦神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦腫瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中常見的致命性疾病，在所有腫瘤中是最易危及生命也是最難治療的。由于化療藥物受限于血腦屏障及藥物的毒副作用，腦腫瘤的治療更加成為目前國際公認(rèn)的醫(yī)學(xué)難題，藥物治療仍沒有明顯突破。青蒿素是具有全新作用機(jī)制的高效抗瘧藥，它的抗瘧作用強(qiáng)而對人的毒副作用很低。最近，在它的抗瘧作用原理的啟發(fā)下，國內(nèi)外不少實(shí)驗(yàn)室研究青蒿素用于抗腫瘤的可能性，發(fā)現(xiàn)青蒿素對多種腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。本課題根據(jù)青蒿素對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和能透過血腦屏障而進(jìn)入腦

2、組織的藥代動力學(xué)特性，推測青蒿素有可能用于治療腦腫瘤，成為腦腫瘤治療的新藥。課題從青蒿素對離體培養(yǎng)大腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生選擇性的分子生物學(xué)機(jī)制和對顱內(nèi)接種神經(jīng)膠質(zhì)瘤動物模型的作用等三個(gè)方面開展實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，青蒿素對大腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的選擇性殺傷作用。而雙氫青蒿素的作用比青蒿素更強(qiáng)。一般化療藥的半數(shù)有效量是在10到100微摩爾的范圍內(nèi)。雙氫青蒿素在該濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，100微摩爾的濃度下，

3、能在24小時(shí)內(nèi)幾乎全部殺滅神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。半數(shù)有效濃度為48微摩爾，與一般化療藥的作用強(qiáng)度相似。但是，用正常非腫瘤細(xì)胞進(jìn)行同樣實(shí)驗(yàn)，顯示青蒿素對正常細(xì)胞的影響明顯低于腫瘤細(xì)胞，與一般化療藥在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也損傷正常細(xì)胞的無選擇性作用有很大的區(qū)別。對青蒿素殺滅神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用特性進(jìn)一步研究，觀察到青蒿素引起腫瘤細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂，出現(xiàn)程序性細(xì)胞凋亡。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)青蒿素處理四小時(shí)后，細(xì)胞死亡率不因藥物的撤離而降低，這種低可逆性現(xiàn)

4、象說明青蒿素與其作用靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的結(jié)合可能是共價(jià)鍵類型的穩(wěn)定結(jié)合。用藥物將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞控制在不同的生長期，然后測試對青蒿素的敏感性，發(fā)現(xiàn)青蒿素對各周期均有作用，但對分裂期(M期)的細(xì)胞作用較強(qiáng)。 青蒿素能對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異選擇性作用的原理是很值得探討的課題。一個(gè)較有根據(jù)的學(xué)說認(rèn)為青蒿素對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異選擇性作用的原因與其抗瘧作用類似，與細(xì)胞內(nèi)的高鐵環(huán)境有關(guān)。腫瘤細(xì)胞由于高速分裂的需要，鐵的濃度比一般的細(xì)胞顯著增高，無活性的青蒿

5、素在高鐵環(huán)境下內(nèi)過氧橋打開而形成具較強(qiáng)細(xì)胞毒性的氧化態(tài)，對細(xì)胞起殺傷作用。但是，青蒿素形成氧化態(tài)后的作用靶點(diǎn)尚不明了。國外有研究用三維立體分子模型模擬青蒿素與其作用靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的結(jié)合方式，提示青蒿素結(jié)構(gòu)中的過氧橋在裂解開環(huán)后，與靶點(diǎn)蛋白的巰基發(fā)生共價(jià)鍵結(jié)合而使其失去功能。根據(jù)這一線索和本研究觀察到的青蒿素作用在細(xì)胞分裂期，引起細(xì)胞凋亡等特性，本課題研究了青蒿素對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞2號氯離子通道的影響。2號氯離子通道是與細(xì)胞分裂、細(xì)胞的體積調(diào)節(jié)

6、和電解質(zhì)調(diào)節(jié)有密切關(guān)系的蛋白質(zhì)。它存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜，在癌變時(shí)表達(dá)量增高。它的調(diào)節(jié)亞基在分子結(jié)構(gòu)上有連續(xù)排列的多個(gè)巰基，有可能成為青蒿素的一個(gè)作用靶點(diǎn)。本研究用膜片鉗方法觀察到青蒿素能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞氯離子通道的電流，再經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡凝膠電泳，證實(shí)青蒿素能降低2號氯離子通道蛋白質(zhì)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜的表達(dá)水平，使細(xì)胞膜氯離子通道的數(shù)目減少。目前尚未發(fā)現(xiàn)任何藥物能選擇性地降低2號氯離子通道蛋白質(zhì)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜表達(dá)水平，青蒿素

7、在這一領(lǐng)域有深入研究的價(jià)值。 為了觀察青蒿素在整體動物身上是否有作用，進(jìn)一步接近臨床治療，本課題制作了顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤動物模型。顱內(nèi)注射將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種到CBA純種小白鼠的腦組織，并在動物顱骨鉆孔安裝記錄電極，十天后用腦電圖出現(xiàn)異常放電和腦切片出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損害來判別腫瘤的形成。移植腫瘤細(xì)胞后，每天腹腔注射10mg/kg雙氫青蒿素，初步觀察到雙氫青蒿素對正常腦組織沒有顯著影響，而腫瘤腦組織的病理切片經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測試劑染色呈陽性，說明

8、青蒿素能透過血腦屏障而到達(dá)顱內(nèi)腫瘤組織，引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。為青蒿素在整體水平上有治療腦腫瘤的作用提供了更直接的證據(jù)。 綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本課題觀察到青蒿素對大腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，對腫瘤殺傷的選擇性可能與青蒿素在腫瘤細(xì)胞高鐵環(huán)境下形成氧化態(tài)，進(jìn)而抑制氯離子通道有關(guān)。同時(shí)，動物模型上初步觀察到了青蒿素能透過血腦屏障到達(dá)腦組織腫瘤部位，引起神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生細(xì)胞調(diào)亡的作用，顯示了青蒿素在臨床上治療腦腫瘤方面取得突破性進(jìn)