血小板反應(yīng)蛋白-1在缺氧人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的表達(dá)及VR-10合成多肽對恒河猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響.pdf

1、第一章缺氧對ARPE-19細(xì)胞表達(dá)TGF-132、VEGF、PEDF及TSP-1的影響 目的：探討缺氧誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細(xì)胞株(ARPE-19)表達(dá)轉(zhuǎn)化生長因子-β2(transforming growthfactor-β2，TGF-β2)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)、色素上皮衍生因子(pigm

2、ent epithelium-derived factor，PEDF)及血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin-1 TSP-1)的情況。 方法：含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，加入150umol/mlCoCl2進(jìn)行化學(xué)缺氧，細(xì)胞免疫熒光染色及WesternBlot技術(shù)檢測ARPE-19細(xì)胞在缺氧0h、4h、8h、12h、24h、48h，TGF-β2、VEGF、PEDF及TSP-1的表達(dá)情

3、況。 結(jié)果：1.細(xì)胞免疫熒光染色ARPE-19細(xì)胞胞漿表達(dá)VEGF蛋白，隨缺氧時間的延長表達(dá)增強(qiáng)，以缺氧24小時最為顯著；ARPE-19細(xì)胞胞漿表達(dá)PEDF蛋白，隨缺氧時間的延長表達(dá)減弱；ARPE-19細(xì)胞胞漿、胞膜、核膜及核仁均有TSP-1及TGF-β2蛋白的表達(dá)，隨缺氧時間的延長表達(dá)減弱。 2.Western Blot技術(shù)檢測ARPE-19細(xì)胞缺氧組表達(dá)VEGF隨時間延長表達(dá)較常氧對照組明顯增加，以24小時達(dá)高峰，缺

4、氧組為常氧組的2.6倍，此后有所下降，缺氧與常氧組除0小時外(P=0.935)，其它各時間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000-0.002)；表達(dá)PEDF、TSP-1及TGF-β2缺氧組較常氧對照組明顯減少，48小時缺氧組分別為常氧組的0.30倍、0.35倍及0.28倍，缺氧與常氧組除0小時外(P=0.125)、(P=0.803)、(P=0.086)，其它各時間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000-0.014)、(P=0.000-0.0

5、03)、(P=0.000-0.001)。 3.缺氧不同作用時間APRE-19表達(dá)PEDF、TGF-β2與TSP-1成正相關(guān)(r=0.902，P=0.000)、(r=0.990，P=0.000)；缺氧不同作用時間APRE-19表達(dá)VEGF與TSP-1成負(fù)相關(guān)(r=-0.853，P=0.000)。 結(jié)論：1.缺氧啟動血管新生可能通過ARPE-19細(xì)胞表達(dá)促血管生成因子VEGF的增加及抗血管生成因子PEDF、TSP-1及TGF

6、-β2的減少實(shí)現(xiàn)。 2.TSP-1不同于作為血管生成正向作用因子的VEGF，可能與PEDF及TGF-β2一同作為血管生成的負(fù)向作用因子參與血管新生性疾病的發(fā)生發(fā)展。 第二章 VR-10合成多肽對恒河猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮(RF/6A)細(xì)胞的作用 目的：探討VR-10合成多肽對猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞株(RF/6A細(xì)胞)增生、移行的作用及對TGF-β2、VEGF、PEDF表達(dá)的影響。 方法：MTT法檢測1μg/m

7、l外源性TSP-1及0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml的VR-10合成多肽在作用6、12、24、48小時后對RF/6A細(xì)胞增殖的影響；Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測作用24小時后對細(xì)胞移行的影響；細(xì)胞免疫熒光染色及RT-PCR技術(shù)檢測對RF/6A細(xì)胞表達(dá)TGF-β2、VEGF、PEDF的影響。 結(jié)果：1.MTT法檢測不同濃度和時間TSP-1及VR-10合成多肽作用RF/6A細(xì)胞存活率：TSP-1及VR-10合成多肽對

8、RF/6A細(xì)胞均有抑制作用，且隨作用時間及濃度的增加，細(xì)胞存活率越低。以作用48小時VR-10合成多肽10μg/ml組細(xì)胞存活率最低為78％(P<0.001)。 2.Transwell小室實(shí)驗(yàn)中TSP-1及VR-10合成多肽對RF/6A細(xì)胞遷移具有抑制作用(P<0.001)；以10μg/ml的VR-10合成多肽抑制率最高，1μg/ml TSP-1全肽抑制率次之。VR-10合成多肽隨濃度增加抑制率越高(P<0.001)；0.1μu

9、g/ml的VR-10合成多肽與1μg/ml的VR-10合成多肽對RF/6A細(xì)胞的抑制率差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.114)。 3.細(xì)胞免疫熒光染色RF/6A細(xì)胞胞漿表達(dá)TGF-β2蛋白，1μg/mlTSP-1處理RF/6A細(xì)胞表達(dá)TGF-β2較空白對照組強(qiáng)，各濃度VR-10合成多肽處理RF/6A細(xì)胞表達(dá)TGF-β2與空白對照組比較無明顯差別；RF/6A細(xì)胞胞漿表達(dá)PEDF蛋白，TSP-1及VR-10合成多肽處理RF/6A細(xì)胞表

10、達(dá)PEDF均較空白對照組表達(dá)增強(qiáng)，以10μg/ml濃度組VR-10合成多肽作用最強(qiáng)；RF/6A細(xì)胞胞漿表達(dá)VEGF蛋白，TSP-1及VR-10合成多肽處理RF/6A細(xì)胞表達(dá)VEGF均較空白對照組表達(dá)減弱，以10μug/ml濃度組VR-10合成多肽作用最強(qiáng)。 4、RT-PCR檢測除1μg/ml濃度TSP-1組處理RF/6A細(xì)胞表達(dá)TGF-β2 mRNA較空白對照組表達(dá)增強(qiáng)外(P=0.000)，其余各組均與空白對照組間比較差異無統(tǒng)計

11、學(xué)意義(P>0.05)；PEDF mRNA均較空白對照組表達(dá)增強(qiáng)，以10μg/ml濃度組VR-10合成多肽作用最強(qiáng)(P<0.001)，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；VEGF mRNA均較空白對照組表達(dá)減弱，以10ug/ml濃度組VR-10合成多肽作用最強(qiáng)(P<0.001)，除1μg/ml濃度組VR-10合成多肽與1μg/mlTSP-1多肽組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外(P=0.615)，其余各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0

12、.001)。 結(jié)論：1.VR-10合成多肽具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、移行的作用。 2.VR-10合成多肽通過上調(diào)抗血管生成因子PEDF，下調(diào)促血管生成因子VEGF的表達(dá)，及TGF-β2非依賴機(jī)制，共同作用而抑制血管新生。 第三章 VR-10合成多肽對RF/6A細(xì)胞表達(dá)Fas/FasL、Caspase-3及Bcl-2的影響 目的：探討VR-10合成多肽對RF/6A細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。 方法：RT

13、-PCR技術(shù)檢測10μg/ml的VR-10合成多肽及空白對照組對RF/6A細(xì)胞表達(dá)Bcl-2及FasL mRNA的影響。Western Blot技術(shù)檢測10μg/ml的VR-10合成多肽及空白對照組對RF/6A細(xì)胞表達(dá)Fas及Caspase-3蛋白的影響。 結(jié)果：1.RT-PCR檢測RF/6A細(xì)胞表達(dá)Bcl-2 mRNA，10μg/mlVR-10合成多肽處理組較空白對照組表達(dá)減少(P=0.000)，RF/6A細(xì)胞表達(dá)FasL m

14、RNA，10μg/mlVR-10合成多肽處理組較空白對照組表達(dá)增強(qiáng)(P=0.001)。 2.WB檢測空白對照組RF/6A細(xì)胞表達(dá)Caspase-3蛋白大多為無活性酶原形式(32KD)；10μg/ml VR-10合成多肽處理RF/6A細(xì)胞主要表達(dá)Caspase-3活性小分子片段(20KD)；10μg/ml VR-10合成多肽處理RF/6A細(xì)胞表達(dá)Fas蛋白較空白對照組增加(P=0.000)。 結(jié)論：VR-10合成多肽通過增