重寄生鏈霉菌F46與放線菌SC11原生質體融合研究.pdf

1、為了提高野生生防放線菌株的防病效果，克服以往生防菌應用方面存在的諸多弊端，探索簡單易行的人工改良生防放線菌的途徑，我們選用重寄生鏈霉菌F46和放線菌SC11作為親本，進行了雙親原生質體融合研究，以期得到整合雙親多種優(yōu)良性狀的工程菌株。 通過測量菌絲干重、顯微觀察計數(shù)和計算再生率的方法對雙親原生質體制備及再生條件進行了優(yōu)化。研究結果表明，菌株F46和SC11分別在蔗糖濃度為20％和10％以及Gly濃度為1.5％和1.0％的培養(yǎng)液中

2、培養(yǎng)96～100h，能夠形成分散度好的菌絲體，酶解時會有大量再生率較高的原生質體形成；在35℃水浴條件下，菌株SC11選用濃度為5mg·mL-1的溶菌酶酶解90min，菌株F46選擇10mg·mL-1溶菌酶與10mg·mL-1蝸牛酶混合，酶解時間以120min為佳。 本研究以處理不同時間后原生質體的再生情況確定了雙親株原生質體的滅活條件。結果表明，在60℃條件下，菌株F46和SC11的原生質體熱滅活時間分別以60min和15mi

3、n適宜；如果在20W紫外燈下15cm處照射處理，菌株F46和SC11原生質體的滅活時間分別為15min和7min。 在優(yōu)化了雙親原生質體形成、再生以及滅活條件的基礎上，經(jīng)過敏感菌絲體培養(yǎng)，原生質體制備，融合及再生的重復試驗，依據(jù)再生培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌落的形態(tài)和顏色分離獲得9株再生菌株。通過比較融合子與親本的抑菌活性，篩選出抑菌效果優(yōu)于親本的融合菌株F-S5、F-S15、F-S16和F-S17。 對于初篩獲得的融合菌株，進一步

4、通過抑菌機理研究、遺傳穩(wěn)定性檢測、形態(tài)特征觀察、培養(yǎng)性狀多重比較、生理生化特性觀察以及生長速率比較發(fā)現(xiàn)，融合菌株與雙親既有差別，又有相同之處，表明雙親原生質體融合后形成的融合菌株既保留了親本的某些特性，又產(chǎn)生了一些新性狀。 利用細菌通用引物對融合菌株及其親本16SrDNA進行擴增，均獲得大小約1.5kb的片段，用限制性內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切，酶切圖譜中既具備與雙親相同的一些條帶，也有完全不同于雙親的新條帶，這可能與融合菌株產(chǎn)生