以羊膜為載體培養(yǎng)口腔粘膜上皮在眼表重建中的應(yīng)用.pdf

1、角膜緣干細(xì)胞位于角膜緣基底層，是角膜上皮細(xì)胞分化和增殖的來(lái)源。眼部化學(xué)傷、熱燒傷、Stevens-Johnson綜合征(Stevens-Johnsonsyndrome，SJS)等多種病因可引起角膜緣干細(xì)胞缺乏(limbalstemcelldeficiency,LSCD)，臨床表現(xiàn)以角膜結(jié)膜化、新生血管、基質(zhì)瘢痕化等為特征，最終導(dǎo)致角膜混濁、潰瘍、穿孔，甚至視力喪失。對(duì)于此類(lèi)由角膜緣干細(xì)胞缺乏導(dǎo)致的嚴(yán)重眼表疾病(ocularsurface

2、disease，OSD)，眼表重建(ocularsurfacereconstruction，OSR)為首選的治療，但常規(guī)手術(shù)方法療效欠佳。結(jié)膜移植術(shù)后出現(xiàn)大量角膜基質(zhì)新生血管，且結(jié)膜組織透明度低，影響患者視力及外觀(guān)。羊膜移植術(shù)后眼表上皮為結(jié)膜表型，且對(duì)于嚴(yán)重干眼、彌漫性上皮角化和角膜緣缺血等患者療效甚微。自體角膜上皮移植(角膜上皮移植術(shù)和角膜緣移植術(shù))僅能治療單眼發(fā)病患者，異體角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)后存在排斥反應(yīng)，影響植片長(zhǎng)期存活。隨著生物

3、工程及再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們嘗試使用體外培養(yǎng)非角膜上皮來(lái)源的復(fù)層非角化上皮細(xì)胞移植片自體移植進(jìn)行眼表重建。本課題目的在于制備兔角膜緣干細(xì)胞衰竭模型，觀(guān)察以脫細(xì)胞羊膜為載體體外培養(yǎng)的人口腔粘膜上皮移植片用于眼表重建的療效及可行性，為人口腔粘膜自體移植提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一章：目的1.探索體外培養(yǎng)人口腔粘膜上皮細(xì)胞的方法。2.體外培養(yǎng)人口腔粘膜上皮細(xì)胞的鑒定。方法取供體口腔頰部粘膜上皮組織制備成單細(xì)胞懸液，以脫細(xì)胞羊膜為載體、3T

4、3成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層，采用氣—液相培養(yǎng)方法構(gòu)建移植片。培養(yǎng)后期對(duì)口腔粘膜上皮細(xì)胞移植片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察及免疫組化染色以鑒定移植片上皮細(xì)胞的表型。結(jié)果以羊膜為載體體外培養(yǎng)的人口腔粘膜上皮細(xì)胞為排列整齊的復(fù)層上皮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，組織學(xué)上類(lèi)似正常人角膜上皮。免疫組化結(jié)果顯示，正常及體外培養(yǎng)的人口腔粘膜上皮均表達(dá)角蛋白K3、K4、K13，角蛋白K10表達(dá)陰性。結(jié)論1.人口腔粘膜上皮為復(fù)層非角化上皮細(xì)胞，生物學(xué)特性與正常人角膜上皮相似，且分化程度低

5、、更新周期短，可作為角膜上皮移植替代物。2.脫細(xì)胞羊膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、抗原性低，可作為體外培養(yǎng)人口腔粘膜上皮細(xì)胞的良好載體。3.采用3T3成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層，氣—液相體外培養(yǎng)人口腔粘膜上皮，細(xì)胞復(fù)層排列整齊，可分化為角膜樣上皮細(xì)胞。4.體外培養(yǎng)的人口腔粘膜上皮細(xì)胞與脫細(xì)胞羊膜貼附緊密，構(gòu)建的口腔粘膜上皮移植片結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。 第二章：目的1.探討使用體外培養(yǎng)人口腔粘膜上皮移植重建眼表的方法。2.評(píng)價(jià)體外培養(yǎng)口腔粘膜上皮移植在眼表重建中的價(jià)值

6、。方法采用環(huán)形板層切除法制備單眼兔角膜緣干細(xì)胞衰竭模型，3-4周后行口腔粘膜上皮片移植術(shù)重建眼表。術(shù)中刮除兔角膜面增生的結(jié)膜化組織及新生血管膜，將體外構(gòu)建的人口腔粘膜上皮移植片平鋪于角膜創(chuàng)面，角膜緣處縫線(xiàn)間斷縫合。術(shù)后每日行裂隙燈檢查，觀(guān)察移植片的存活狀況及眼表的穩(wěn)定性。術(shù)后1月取兔角膜組織進(jìn)行組織學(xué)切片和免疫組化染色明確上皮來(lái)源。結(jié)果制備角膜緣干細(xì)胞衰竭模型術(shù)后，1只兔因術(shù)眼感染自然死亡；余9只兔術(shù)眼出現(xiàn)角膜結(jié)膜化、新生血管及角膜混濁

7、等角膜緣干細(xì)胞缺乏表現(xiàn)。7只兔行眼表重建術(shù)后，6只兔植片存活情況良好，1％熒光素鈉染色陰性，角膜透明度較術(shù)前不同程度提高，移植片下方見(jiàn)新生血管增殖，局限于角膜周邊區(qū)；1只白兔因術(shù)后3天羊膜脫落更換移植片，二次術(shù)后植片存活良好，角膜透明程度提高。術(shù)后1月角膜HE染色見(jiàn)復(fù)層上皮細(xì)胞排列緊密，免疫組化結(jié)果角蛋白K3、K4、K13表達(dá)陽(yáng)性。結(jié)論1.體外培養(yǎng)的人口腔粘膜上皮移植重建兔眼表后，移植片上皮細(xì)胞排列與正常人角膜上皮類(lèi)似，免疫組化染色證實(shí)